Nessuna up-regulation di CAP1, ma un’elevata fosforilazione S308/S310, è stata rilevata in cellule di cancro pancreatico
I livelli proteici di CAP1 sono stati determinati in Western blotting in un pannello di linee cellulari di cancro pancreatico comunemente usate {PANC-126, CFPAC-127, AsPC-128 e Mia PaCa-229}, e confrontati con quelli della linea cellulare immortalizzata ma non trasformata del pancreas hTERT-HPNE30, che serve come controllo. Come mostrato in Fig. 1A, tutte e quattro le linee cellulari tumorali esprimono livelli abbondanti di CAP1 che è paragonabile a quello delle cellule HeLa, che abbiamo precedentemente riportato esprimere livelli abbondanti sia di CAP1 che di CAP212. Abbiamo trovato che le cellule hTERT-HPNE non trasformate esprimevano livelli comparabili di CAP1 a quelli delle linee cellulari tumorali. Abbiamo anche esaminato i livelli di espressione dell’altra isoforma CAP, CAP2, e abbiamo scoperto che le cellule PANC-1 e Mia PaCa-2 avevano un’espressione CAP2 notevolmente aumentata rispetto a quella delle cellule hTERT-HPNE (Fig. 1A).
L’elevata fosforilazione S308/S310 su CAP1, ma non l’espressione CAP1 up-regolata, è stata rilevata nelle cellule di cancro pancreatico. (A) Il Western blot rivela abbondanti livelli di espressione di CAP1 paragonabili a quelli delle cellule HeLa sono stati rilevati in tutte e quattro le linee cellulari tumorali, e le cellule del pancreas di controllo (hTERT-HPNE) hanno un livello di espressione di CAP1 simile. I risultati del blot di CAP2 mostrano che le cellule tumorali PANC-1 e Mia PaCa-2 esprimono abbondanti livelli di CAP2 che erano notevolmente più alti di quelli delle cellule di controllo hTERT-HPNE. (B) Il Western blot rivela un’elevata fosforilazione S308/S310 su CAP1 nelle cellule tumorali pancreatiche PANC-1 e CFPAC-1 rispetto a quella nelle cellule del pancreas non trasformate hTERT-HPNE. L’anticorpo fosforo-specifico riconosce i segnali di fosforo su entrambi i residui. Le sequenze allineate in alto mostrano le sequenze che circondano il sito tandem fosforo-regolatore. I residui di serina (S307 & S309 su mouse CAP1; S308 & S310 su umano CAP1) nel sito tandem sono evidenziati in grassetto e in corsivo (anche sottolineato). I segnali di fosforo sono stati quantificati utilizzando la densitometria, e i risultati di tre esperimenti sono stati analizzati in Student’s t-test e tracciati nel grafico dove le barre di errore rappresentano S.E.M. “*” indica P < 0.05 e “**” indica P < 0.01. (C) Il trattamento delle cellule con l’inibitore GSK3 6-BIO per 16 ore ha ridotto notevolmente la fosforilazione di CAP1 sia nelle cellule di cancro pancreatico PANC-1 che nelle cellule hTERT-HPNE, in modo dose-dipendente. 6-BIO ha anche ridotto la fosforilazione di CAP1 nelle cellule CFPAC-1 in modo simile (non mostrato). GAPDH serve come controllo di carico nel Western blotting.
Abbiamo precedentemente riportato che GSK3 fosforila S309 su CAP124 del topo (equivalente a S310 su CAP1 umano; sequenze allineate mostrate in Fig. 1B). Dato il segnalato iper-attivazione di GSK3 nel cancro pancreatico 25, abbiamo esaminato il potenziale elevazione della fosforilazione S308/S310 su CAP1 in cellule tumorali, utilizzando un fosforo-specifico anticorpo che riconosce i segnali di fosforo su entrambi i residui di serina in Western blotting24. È interessante notare che la fosforilazione S308/310 era significativamente elevata nelle cellule tumorali rispetto a quella nelle cellule di controllo (Fig. 1B, mostrato con dati quantificati per PANC-1 e CFPAC-1 linee cellulari solo, ma risultati simili sono stati ottenuti con AsPC-1 e Mia PaCa-2 cellule). Successivamente, abbiamo inibito GSK3 trattando le cellule tumorali con un potente inibitore GSK3 6-BIO (6-bromoindirubina-3′-oxime)31 e abbiamo scoperto che il trattamento ha ridotto la fosforilazione S308/S310 su CAP1 nelle cellule PANC-1 e CFPAC-1, in modo dose-dipendente (Fig. 1C, mostrato solo per le cellule PANC-1). Il trattamento con 6-BIO ha anche ridotto la fosforilazione di CAP1 nelle cellule del pancreas di controllo. Coerentemente, un inibitore GSK3 più selettivo, LiCl32, ha anche ridotto la fosforilazione di CAP1 nelle cellule PANC-1 e AsPC-1, come mostrato in seguito. Questi risultati supportano che GSK3 è anche parte del macchinario di fosforilazione di CAP1 a S308/S310 nelle cellule di cancro pancreatico. Si nota anche che il trattamento delle cellule tumorali e delle cellule di controllo con 6-BIO ha portato costantemente a una notevole up-regolazione di CAP1, attraverso un meccanismo sconosciuto.
Knockdown di CAP1 ha portato a un aumento delle fibre di stress e a una riduzione della motilità e dell’invasione delle cellule tumorali
Allora abbiamo cercato di silenziare CAP1 per determinare il ruolo di CAP1 nelle cellule tumorali pancreatiche. Il paradigma di knockdown stabile che abbiamo precedentemente sviluppato è compatibile con una strategia di salvataggio, che permette di verificare la specificità dei fenotipi derivati dalla deplezione di CAP112,18,24. Utilizzando due costrutti shRNA S2 e S3 che mirano sequenze nucleotidiche indipendenti e efficacemente silenziato CAP1 in HeLa e cellule di cancro al seno 12,18,24,33, siamo stati in grado di generare cloni stabili con efficiente CAP1 knockdown nelle cellule PANC-1 e AsPC-1, come confermato in Western blotting (Fig. 2A). Due cloni stabili knockdown ciascuno derivato da PANC-1 (S2-1 e S3-3) e AsPC-1 (S2-3 e S2-7), sono stati stabiliti rispettivamente attraverso la selezione Neomycin. In particolare, i tentativi di silenziare CAP1 in CFPAC-1 e Mia PaCa-2 linee cellulari tumorali, tuttavia, non hanno avuto successo. Le cellule CFPAC-1 non sono riuscite a formare colonie dopo la selezione antibiotica, mentre nessuna delle circa due dozzine di colonie stabili esaminate aveva una riduzione sostanziale dell’espressione di CAP1 nelle cellule Mia PaCa-2 (dati non mostrati).
Knockdown di CAP1 nelle cellule tumorali ha portato ad un aumento delle fibre di stress di actina, e una riduzione della motilità cellulare e dell’invasione. (A) Abbattimento efficiente di CAP1 in due cloni stabili ciascuno per entrambe le cellule PANC-1 e AsPC-1 come confermato dal Western blotting. CAP1 è stato rilevato in Western blotting, dove GAPDH è stato usato come controllo di carico. (B) La deplezione di CAP1 nelle cellule PANC-1 ha portato ad un aumento delle fibre di actina. Nelle cellule di controllo che ospitano il vettore vuoto per lo shRNA (Vec), c’erano fibre di stress di actina molto limitate (indicate con le frecce). Al contrario, nelle cellule CAP1-knockdown (S2-1 e S3-3), le fibre di actina sono state potenziate (indicate con le frecce) come osservato nella microscopia a fluorescenza dopo la colorazione con la falloidina. (C) La deplezione di CAP1 ha ridotto la motilità in entrambe le cellule PANC-1 e AsPC-1 come rilevato nella guarigione della ferita e nei test di migrazione Transwell (solo per PANC-1). Per i saggi di migrazione Transwell, ~2 × 104 cellule siero-strette durante la notte sono state caricate su ogni inserto posto in un pozzo caricato con mezzo contenente siero. Dopo 16 ore, le cellule migrate sono state valutate e i dati di tre esperimenti indipendenti sono stati raccolti, analizzati con il test t di Student, e tracciati nel grafico dove le barre di errore rappresentano S.E.M. “*” indica P < 0.05 rispetto a quello nelle cellule di controllo che portano un vettore vuoto (Vec). (D) La deplezione di CAP1 ha ridotto l’invasione del Matrigel nelle cellule PANC-1. I saggi, la raccolta dei dati e le analisi sono stati condotti in modo simile a quelli dei saggi di migrazione Transwell, eccetto che le membrane dell’inserto sono state pre-rivestite con Matrigel. “*” indica P < 0,05 rispetto a quello delle cellule di controllo. (E) Riduzione dell’EMT nelle cellule PANC-1 knockdown di CAP1, come indicato dall’aumento dell’espressione di E-Caderina e dalla riduzione dei livelli di espressione di Vimentina nei cloni stabili CAP1-knockdown. GAPDH serve come controllo di carico nei Western blot.
Abbiamo prima esaminato le alterazioni morfologiche e del citoscheletro di actina nelle cellule PANC-1 e AsPC-1 CAP1-knockdown. A differenza dell’aumento delle dimensioni delle cellule in HeLa e nelle cellule metastatiche di cancro al seno12,18,24, la deplezione di CAP1 non ha causato un aumento notevole delle dimensioni delle cellule PANC-1 o AsPC-1. Abbiamo poi colorato il citoscheletro di actina nelle cellule PANC-1 con la falloidina, seguita dalla microscopia a fluorescenza. Le cellule PANC-1 (e le cellule del cancro pancreatico in generale) sembrano avere strutture del citoscheletro di actina poco organizzate, soprattutto in termini di fibre di stress (Fig. 2B), rispetto alle linee cellulari comunemente usate per studi sul citoscheletro di actina, come HeLa e NIH3T3 fibroblasti12,24. Tuttavia, le fibre di stress migliorate erano evidenti nelle cellule PANC-1 CAP1-knockdown rispetto alle cellule di controllo (Fig. 2B). Tutte le 26 cellule di controllo che ospitano un vettore vuoto esaminate hanno mostrato una presenza molto limitata di fibre di stress. Al contrario, 20 su 27 (74,1%) di S2-1 e 18 su 23 (78,3%) delle cellule S3-3 CAP1-knockdown esaminate avevano fibre di stress notevolmente aumentate, come mostrato in Fig. 2B. L’accumulo di fibre di stress è stato costantemente osservato in altre cellule con deplezione di CAP112,13, un fenotipo che si ritiene sia derivato dalla perdita di entrambe le funzioni di CAP1 nel sequestrare i monomeri di actina e nel promuovere il turnover dei filamenti di actina.
Consistente con le fibre di stress migliorate, la deplezione di CAP1 è stata riportata per ridurre la motilità in una serie di tipi di cellule di mammiferi, comprese le cellule tumorali13,14,17,18,19. Abbattimento transitorio di CAP1 in cellule tumorali pancreatiche è stato anche trovato per ridurre la motilità delle cellule in saggi di guarigione delle ferite 14. Abbiamo testato l’effetto della riduzione stabile di CAP1 sull’invasività delle cellule tumorali pancreatiche, conducendo saggi di guarigione delle ferite, saggi di migrazione Transwell e saggi di invasione Matrigel. Deplezione di CAP1 sostanzialmente ridotto la motilità delle cellule nei saggi di guarigione delle ferite sia per PANC-1 e AsPC-1 cellule (Fig. 2C), che è coerente con i risultati precedentemente riportati 14. Le ferite nelle cellule PANC-1 CAP1-knockdown (sia S3-3 che S2-1) sono guarite solo marginalmente 24 ore dopo l’introduzione, mentre nelle cellule di controllo la ferita era quasi completamente riempita. Effetti simili sono stati osservati nei cloni stabili CAP1-knockdown AsPC-1 S2-3 e S2-7 (Fig. 2C). I risultati dei test di migrazione Transwell delle cellule PANC-1 erano coerenti con quelli dei test di guarigione delle ferite, come mostrato nel grafico dei risultati quantificati nel pannello inferiore (Fig. 2C). Inoltre, i saggi di invasione rivelano che la deplezione di CAP1 ha anche ridotto la capacità delle cellule tumorali PANC-1 di penetrare e invadere attraverso il Matrigel (Fig. 2D). Le analisi t-test di Student dei dati raccolti da tre saggi indipendenti rivelano un’invasione significativamente ridotta nelle cellule PANC-1 stabili CAP1-knockdown (Fig. 2D). Infine, poiché l’EMT (Transizione Epiteliale-Mesenchimale) è legata all’invasività delle cellule tumorali, abbiamo testato il potenziale effetto di CAP1 knockdown sull’EMT. Infatti, le cellule PANC-1 CAP1-knockdown avevano E-Caderina up-regolata, il che indica una ridotta EMT (Fig. 2E). Abbiamo anche testato un altro marcatore EMT, Vimentin, e abbiamo trovato che la deplezione di CAP1 ha ridotto la sua espressione (Fig. 2E). Insieme, questi risultati supportano un ruolo necessario per CAP1 nell’invasività e nell’EMT nelle cellule tumorali PANC-1.
L’inibizione di GSK3, che sopprime la fosforilazione di CAP1, ha ridotto la motilità e l’invasione delle cellule tumorali
I nostri risultati precedenti suggeriscono che la fosforilazione transitoria è fondamentale per la funzione di CAP1 nella regolazione del citoscheletro di actina24. L’elevata fosforilazione di CAP1 nelle cellule tumorali pancreatiche, coerente con la GSK3 attivata, suggerisce che la fosforilazione può anche svolgere un ruolo per la funzione di CAP1 nell’invasività delle cellule tumorali. Abbiamo testato questa possibilità inibendo GSK3, che sopprime la fosforilazione S308/S310 e nel frattempo interrompe la regolazione di CAP1 attraverso una fosforilazione transitoria al sito regolatore. Le cellule PANC-1 sono state trattate con 6-BIO seguito da saggi di migrazione e invasione cellulare. Gli effetti della ridotta fosforilazione S308/S310 su CAP1, mediante trattamento con 5 μM 6-BIO (Fig. 1C), sono stati testati per primi. Come mostrato in Fig. 3A, il trattamento 6-BIO ha ridotto significativamente la motilità delle cellule PANC-1 in entrambi i saggi di guarigione della ferita e di migrazione Transwell. Abbiamo anche confermato che il trattamento delle cellule PANC-1 e AsPC-1 con un altro inibitore GSK3, LiCl, ha ridotto la fosforilazione di CAP1 e la motilità delle cellule nei test di guarigione delle ferite (Fig. 3A,B). Inoltre, il trattamento 6-BIO ha anche ridotto l’invasione del Matrigel delle cellule PANC-1 (Fig. 3C). Infine, poiché GSK3 è noto per regolare una vasta gamma di funzioni cellulari attraverso una pletora di molecole substrato, l’effetto dell’inibizione di GSK3 sulla motilità cellulare è probabile che sia un output collettivo attraverso più obiettivi GSK3 che sono coinvolti nella regolazione del citoscheletro, polarizzazione cellulare e migrazione34,35. Abbiamo quindi testato e confrontato gli effetti del 6-BIO nel ridurre la motilità cellulare nelle cellule PANC-1 CAP1-knockdown e nelle cellule di controllo. Come mostrato nel grafico in Fig. 3D, il trattamento 6-BIO ha ridotto significativamente la motilità delle cellule di controllo (Vec) ma non quella delle cellule CAP1-knockdown (S2-1 e S3-3) nei saggi di guarigione della ferita. Nel complesso, questi risultati supportano che la fosforilazione attraverso S308/S310 gioca un ruolo importante per CAP1 nel promuovere la motilità e l’invasione nelle cellule di cancro pancreatico.
L’inibizione di GSK3, che ha ridotto la fosforilazione di CAP1, ha anche compromesso la motilità e l’invasione delle cellule tumorali. (A) Il trattamento delle cellule PANC-1 con 6-BIO o LiCl ha ridotto la motilità delle cellule nei test di guarigione della ferita e di migrazione Transwell. Il trattamento con 100 mM LiCl ha ridotto efficacemente anche la fosforilazione di CAP1 nelle cellule PANC-1. I saggi di migrazione Transwell con le cellule PANC-1 sono stati condotti in modo simile come descritto in Fig. 2 dove NT indica le cellule senza trattamento 6-BIO. (B) Il trattamento con 100 mM LiCl ha anche ridotto notevolmente la fosforilazione di CAP1 nelle cellule AsPC-1, così come la motilità delle cellule nei test di guarigione delle ferite. (C) Il trattamento delle cellule PANC-1 con 5 μM 6-BIO ha ridotto significativamente l’invasione delle cellule tumorali nei saggi di invasione del Matrigel. I saggi di invasione del Matrigel, compresa la raccolta dei dati e le analisi, sono stati condotti in modo simile come descritto in Fig. 2D. (D) La riduzione di CAP1 nelle cellule PANC-1 ha compromesso l’effetto del 6-BIO nel ridurre la motilità cellulare nei saggi di guarigione delle ferite. Controllo e CAP1-knockdown stabile PANC-1 cloni sono stati coltivati per 16 ore dopo l’introduzione della ferita, e le linee tratteggiate indicano i bordi del gap iniziale. La motilità delle cellule è stata quantificata, analizzata con il test t di Student e tracciata nel grafico dove le barre di errore rappresentano la deviazione standard. “*” indica P < 0,05 e “**” indica P < 0,01.
I mutanti fosforici di CAP1 avevano funzioni compromesse nell’alleviare le fibre di stress potenziate e nel promuovere lo sviluppo di lamellipodia nelle cellule PANC-1 CAP1-knockdown
I nostri risultati dalle cellule CAP1-knockdown supportano che CAP1 è richiesto per la motilità e l’invasione delle cellule tumorali, e i risultati dell’inibizione di GSK3 suggeriscono che la fosforilazione S308/S310 gioca un ruolo chiave nelle funzioni di CAP1. Abbiamo poi impiegato una strategia di riespressione per stabilire ulteriormente questi casi. Wild type CAP1 (WTCAP1) e i mutanti fosforici che imitano sia fosforilato (S307D/S309D; DD) o unphosphorylatable (S307A/S309A; AA) forme di CAP1, come descritto in precedenza 12,18,24, sono stati stabilmente ri-espressi nelle cellule PANC-1 CAP1-knockdown per testare le loro capacità di salvare il citoscheletro di actina e fenotipi morfologici cellulari. Questi mutanti portano dei mismatch alla sequenza target di shRNA S3 per evitare il riconoscimento degli mRNA derivati da parte degli shRNA presenti in modo stabile nelle cellule knockdown, ma senza alterare alcun amminoacido su CAP112. Siamo stati in grado di stabilire cloni stabili che ri-esprimere WT mouse CAP1, o il mutante AA e DD fosforo, come confermato in Western blotting contro il tag 6xHis (Fig. 4A). Si noti che due corsie irrilevante era stato rimosso dall’immagine originale Western blot (campioni in quelle due corsie sono stati utilizzati per confermare la riespressione di due serina 36 mutanti fosforo al N-terminale). L’intero set del risultato originale Western blot è mostrato nella Fig. 1 supplementare. La morfologia delle cellule ri-esprimere sia il AA (AA-R) o DD (DD-R) mutante è stato esaminato in microscopia di fase, e rispetto a quello nelle cellule ri-esprimere WTCAP1 (WT-R). È stato segnalato che knockdown di CAP1 in alcuni tipi di cellule di mammiferi, tra cui HeLa e cellule di carcinoma mammario metastatico, ha portato a dimensioni delle cellule significativamente aumentato 12,13,18, un fenotipo abbiamo precedentemente confermato di essere specifico per knockdown di CAP112,18. CAP1-knockdown in cellule PANC-1 o cellule AsPC-1, tuttavia, non ha mostrato questo effetto. Piuttosto, la riespressione stabile di WTCAP1 o dei mutanti al fosforo nelle cellule knockdown ha effettivamente aumentato significativamente le dimensioni delle cellule (Fig. 4B). Inoltre, la riespressione di WTCAP1 ha portato allo sviluppo di lamellipodi di dimensioni robuste (indicati con le frecce), una struttura subcellulare che è ricca di actina filamentosa ed è fondamentale nel guidare il movimento cellulare direzionale (Fig. 4C), mentre praticamente nessuna delle cellule knockdown che portavano un vettore di controllo vuoto ha sviluppato tali lamellipodi. Ri-espresso AA o DD mutante anche stimolato la formazione di lamellipodia in una certa misura, ma le loro dimensioni erano notevolmente più piccole rispetto a quella nelle cellule ri-esprimere WTCAP1 (indicato con frecce in Fig. 4C). Abbiamo contato 200 cellule per ogni tipo di cellula, e le percentuali di cellule che ospitano lamellipodi di grandi dimensioni erano: 0% (0/200) per le cellule knockdown (Vec), 14,5% (29/200) per le cellule WT-R, e 9% (18/200) e 7,5% (15/200), rispettivamente, per le cellule AA-R e DD-R.
Effetti della riespressione di WTCAP1 e dei mutanti del fosforo nelle cellule PANC-1 CAP1-knockdown sul citoscheletro di actina, le dimensioni delle cellule e lo sviluppo dei lamellipodi. (A) Conferma della riespressione di WTCAP1 e dei mutanti di fosforo AA e DD nelle cellule stabili S3-3 CAP1-knockdown PANC-1 in Western blotting usando l’anticorpo contro il tag 6xHis. Due corsie irrilevanti sono state rimosse dall’immagine originale del Western blot (mostrata nella Fig. 1 supplementare); (B) dati quantificati che mostrano un aumento significativo delle dimensioni delle cellule nelle cellule che riesprimono WTCAP1 o i mutanti del fosforo nelle cellule CAP1-knockdown. Dimensioni di 50 cellule per campo sono state misurate utilizzando il programma Image-J. I dati sono stati analizzati utilizzando il t-test di Student, e tracciati nel grafico dove le barre di errore indicano la deviazione standard. “*” indica P < 0,05 rispetto alle cellule di controllo che portano il vettore vuoto (Vec-R). (C) Le immagini di fase mostrano che la riespressione di WTCAP1 o dei mutanti del fosforo ha stimolato la formazione di lamellipodia. Alcune delle cellule che riesprimono WTCAP1 (WT-R) hanno sviluppato lamellipodi di dimensioni estremamente grandi (indicati con frecce). La riespressione del mutante AA (AA-R) o DD (DD-R) ha anche simulato la formazione di lamellipodi, ma le loro dimensioni sono notevolmente più piccole rispetto a quelle delle cellule che riesprimono WTCAP1. Nessuna lamellipodia è stata osservata nelle cellule di controllo CAP1-knockdown che ospitano il vettore vuoto (Vec-R). (D) La riespressione di WTCAP1 nelle cellule PANC-1 CAP1-knockdown ha ridotto le fibre di stress, mentre le cellule che riesprimevano i mutanti avevano fibre di stress potenziate. Le cellule che riesprimono il mutante DD fosforomimetico avevano le fibre di stress più potenziate. Le frecce indicano le fibre di stress, o la loro mancanza nel caso delle cellule WT-R.
Allora abbiamo esaminato le capacità dei mutanti del fosforo di alleviare le fibre di stress aumentate nelle cellule PANC-1 CAP1-knockdown. Come mostrato nelle immagini confocali in Fig. 4D, la riespressione di WTCAP1 (WT-R) ha efficacemente alleviato le fibre di stress potenziate, salvando così il fenotipo, e le fibre di stress sono state dissolte in grandi aree indicate con una freccia. Al contrario, i mutanti al fosforo sono stati meno efficaci nell’alleviare le fibre di stress potenziate. Le cellule che riesprimevano il mutante AA avevano fibre di stress modestamente aumentate rispetto alle cellule salvate da WTCAP1, mentre le cellule che riesprimevano il mutante DD sembravano avere fibre di stress ancora più aumentate. Questi risultati sono coerenti con le nostre precedenti scoperte sulle cellule HeLa che suggeriscono che CAP1 defosforilato è la forma “attiva” rispetto a CAP124 fosforilato, mentre si ritiene che la fosforilazione transitoria sia necessaria per le funzioni cellulari ottimali di CAP1. Questi risultati suggeriscono anche che la fosforilazione transitoria S308/S310 è importante per CAP1 per regolare il citoscheletro di actina nelle cellule del cancro pancreatico; l’interruzione della regolazione attraverso la fosforilazione transitoria porta a difetti nella funzione di CAP1 nel promuovere il turnover dei filamenti di actina.
I mutanti fosforici di CAP1 avevano difetti nel salvare la ridotta invasività nelle cellule tumorali CAP1-knockdown
Siccome il turnover dinamico dei filamenti di actina è la forza motrice primaria del movimento cellulare, abbiamo poi testato quanto bene i mutanti fosforici salvino la ridotta motilità e invasione cellulare nelle cellule PANC-1 CAP1-knockdown. Abbiamo prima condotto dei saggi di migrazione Transwell, e abbiamo scoperto che la riespressione di WTCAP1 ha aumentato significativamente la motilità cellulare rispetto alle cellule di controllo che ospitano un vettore vuoto, come mostrato nei risultati quantificati nel grafico (Fig. 5A). Il mutante AA riespresso (AA-R), pur non essendo efficace come WTCAP1, ha parzialmente salvato la ridotta motilità cellulare nei test di migrazione Transwell. Al contrario, il mutante DD (DD-R) non è riuscito a salvare la ridotta motilità cellulare, e il tasso era paragonabile a quello delle cellule CAP1-knockdown che portavano un vettore vuoto. Questi risultati sono coerenti con le capacità di salvataggio delle fibre di stress potenziate da WTCAP1 e dai mutanti del fosforo. Abbiamo ulteriormente testato il salvataggio della ridotta invasione del Matrigel nelle cellule CAP1-knockdown, come mostrato nei risultati quantificati in Fig. 5B. Allo stesso modo, WTCAP1 ha salvato l’invasione ridotta nelle cellule PANC-1 CAP1-knockdown in modo più efficace; il mutante AA ha ottenuto un salvataggio parziale mentre il mutante DD non è riuscito letteralmente a salvare il fenotipo. Infine, la riespressione di WTCAP1 nelle cellule CAP1-knockdown ha anche ridotto l’espressione di E-Caderina (Fig. 5C), sostenendo ulteriormente che CAP1 è necessario per l’EMT nelle cellule tumorali PANC-1. Insieme, questi risultati supportano che la fosforilazione attraverso il sito tandem S308/S310 gioca un ruolo importante per CAP1 nel promuovere la motilità e l’invasione delle cellule tumorali pancreatiche.
Effetti di WTCAP1 e dei mutanti del fosforo nel salvataggio della ridotta motilità e invasione nelle cellule PANC-1 CAP1-knockdown. (A) WTCAP1 e il mutante AA hanno efficacemente salvato la ridotta motilità delle cellule PANC-1 CAP1-knockdown nei test di migrazione Transwell, mentre il mutante DD non è riuscito a farlo. Gli esperimenti, la raccolta dei dati e le analisi sono stati condotti in modo simile a quello descritto nella Fig. 2. Le barre di errore rappresentano S.E.M., e “*” indica P < 0.05 rispetto alle cellule di controllo che portano un vettore vuoto (Vec-R). (B) WTCAP1 e il mutante AA hanno efficacemente salvato la ridotta invasione del Matrigel delle cellule PANC-1 CAP1-knockdown, mentre il mutante DD non è riuscito a farlo. Gli esperimenti, la raccolta dei dati e le analisi sono stati condotti in modo simile a quello descritto in Fig. 2. Le barre di errore rappresentano S.E.M., e “*” indica P < 0,05 rispetto alle cellule di controllo. (C) La riespressione di WTCAP1 ha anche salvato l’up-regolazione di E-Cadherin nelle cellule PANC-1 CAP1-knockdown.
Prove a sostegno del fatto che CAP1 media i segnali dei fattori di crescita extracellulari per controllare l’invasività delle cellule tumorali
Stimoli fisiologici, come i fattori di crescita PDGF e HGF (Hepatocyte Growth Factor)36, sono noti per stimolare il riarrangiamento del citoscheletro di actina e la migrazione cellulare. Poiché la fosforilazione a S308/S310 è cruciale per le funzioni di CAP1 nella regolazione del citoscheletro di actina e dell’invasività delle cellule tumorali, abbiamo esaminato la possibilità che questi stimoli possano regolare la fosforilazione di CAP1, e attraverso questa controllare il riarrangiamento del citoscheletro di actina e l’invasività delle cellule tumorali. È interessante notare che il trattamento delle cellule PANC-1 e AsPC-1 stanche di siero con PDGF ha ridotto la fosforilazione S308/S310 su CAP1, soprattutto al punto temporale di 5 minuti (Fig. 6A,B). Il trattamento delle cellule di cancro pancreatico con HGF o siero non ha avuto un effetto considerevole nell’indurre la defosforilazione di CAP1 (Fig. 2 supplementare; mostrato per le cellule PANC-1). Pertanto, la segnalazione attraverso CAP1 è probabilmente almeno parzialmente responsabile del fatto che PDGF stimoli la riorganizzazione del citoscheletro di actina e l’invasività delle cellule tumorali. Questi risultati sono anche coerenti con la nozione che CAP1 defosforilato è la forma ‘attiva’, come suggerito da più linee di prova tra cui il legame cofilina, localizzazione subcellulare dei mutanti fosforici, ed elevata fosforilazione di CAP1 in cellule coltivate in sospensione24. Tuttavia, la fosforilazione transitoria al sito di regolazione tandem, vale a dire il ciclismo tra le forme fosforilate e defosforilate, si ritiene sia necessaria per le funzioni cellulari ottimali di CAP124. I segnali di defosforilazione di CAP1 funzionano probabilmente in coorte con i segnali di fosforilazione di CAP1, per regolare le funzioni cellulari di CAP1 attraverso la guida della fosforilazione transitoria a S308/S310.
PDGF induce la defosforilazione di CAP1 in cellule di cancro pancreatico. (A) Il trattamento delle cellule tumorali AsPC-1 affamate di siero con PDGF ha indotto la defosforilazione di CAP1 a S308/S310. Le cellule sono state coltivate durante la notte, siero-strette per 24 ore, seguite dal trattamento con 30 ng/ml PDGF per la durata indicata. I lisati cellulari sono stati preparati e utilizzati nel Western blotting con un anticorpo fosforo-specifico che rileva i segnali di fosforo su entrambi i residui del sito regolatore tandem su CAP1. L’effetto di defosforilazione è stato più significativo al punto di tempo di 5 minuti di trattamento con PDGF. (B) Il trattamento delle cellule PANC-1 stanche di siero con PDGF ha anche indotto una notevole defosforilazione di CAP1, in modo simile alle cellule AsPC-1. Il trattamento delle cellule e il Western blotting sono stati condotti seguendo le stesse procedure utilizzate per le cellule AsPC-1. GAPDH è servito come controllo di carico in Western blot.
La deplezione di CAP1 in cellule di cancro pancreatico ha ridotto l’attività di FAK ma non ha causato alterazioni in ERK o proliferazione cellulare
Di recente abbiamo identificato un nuovo ruolo per CAP1 nella regolazione della proliferazione delle cellule di cancro al seno, dove la deplezione di CAP1 esercita effetti dipendenti dal contesto cellulare sulla proliferazione, accompagnati da alterazioni coerenti in attività ERK18. Abbiamo testato se CAP1 può anche regolare ERK e proliferazione in cellule di cancro pancreatico. Nessuna alterazione significativa nell’espressione o fosforilazione di ERK è stata rilevata nei cloni stabili PANC-1 CAP1-knockdown rispetto a quello nelle cellule di controllo (Fig. 3A supplementare). Abbiamo anche condotto test MTT per testare la proliferazione delle cellule S2-1 e S3-3 stabili knockdown e confrontarle con quelle delle cellule di controllo (Vec), e abbiamo rilevato tassi leggermente diminuiti di proliferazione cellulare nelle cellule knockdown (Fig. 3B supplementare). Tuttavia, le differenze erano staticamente insignificanti, con i valori P che confrontano l’O.D. (a 570 nm) tra le cellule S2-1 e le cellule di controllo a 0,219, e quello tra le cellule S3-3 e le cellule di controllo a 0,223. Questi risultati indicano che CAP1 non svolge un ruolo significativo nella regolazione della proliferazione nelle cellule del cancro del pancreas. Inoltre, dato che la tendenza generale che il paradigma knockdown stabile è incline a variazioni clonali, abbiamo generato pool di cellule PANC-1 knockdown stabile CAP1, che si ritiene di riflettere più accuratamente gli effetti della deplezione CAP1 su ERK, evitando la potenziale influenza di bias di selezione. Come mostrato in Fig. 7A, i pool di cellule PANC-1 stabili con knockdown CAP1 efficiente, derivato da entrambi i costrutti S2 e S3 shRNA, sono stati stabiliti dopo la selezione Neomycin, come confermato in Western blotting. Coerentemente con i risultati ottenuti utilizzando cloni stabili knockdown, nessuna alterazione notevole nell’espressione di ERK o nella sua fosforilazione è stata rilevata nelle cellule del pool knockdown rispetto alle cellule del pool di controllo.
Le cellule del pool PANC-1 knockdown di CAP1 avevano una ridotta attività FAK e adesione cellulare, ma nessuna alterazione di ERK. (A) Le cellule del pool PANC-1 CAP1-knockdown, derivate da entrambi i costrutti S2 e S3 shRNA, non hanno mostrato un’alterazione dell’espressione o dell’attività di ERK rispetto alle cellule del pool di controllo che ospitavano un vettore vuoto, come rilevato nel Western blotting. L’attività di ERK è stata rilevata in Western blotting utilizzando un anticorpo fosforo-specifico contro i siti Thr202/Tyr204. GAPDH è servito come controllo di carico. (B) Una ridotta attività di FAK è stata rilevata nelle cellule del pool CAP1-knockdown PANC-1 rispetto alle cellule del pool di controllo. L’attività di FAK è stata valutata dalla fosforilazione a Tyr397, usando un anticorpo fosforo-specifico contro il sito in Western blotting; (C) le cellule del pool CAP1-knockdown avevano una ridotta adesione cellulare nei punti di tempo testati (45 minuti e 2 ore) dopo aver piastrato le cellule su piastre rivestite di fibronectina. Circa 2 × 104 cellule sono state placcate su ogni pozzetto di una piastra a 6 pozzetti, e le cellule non attaccate ai punti di tempo indicati sono state lavate via. Il numero di cellule attaccate è stato contato in cinque campi casuali sotto un microscopio di fase e le immagini prese. (D) I dati raccolti da tre saggi di adesione delle cellule indipendenti sono stati analizzati utilizzando il test t di Student, e tracciati sul grafico dove le barre di errore rappresentano la deviazione standard. “**” Indica P < 0,01 rispetto alle cellule di controllo che ospitano il vettore vuoto.
Knockdown di CAP1 in cellule di cancro al seno causato alterazioni distinte in FAK nelle cellule di cancro al seno metastatico e non-metastatico18. Abbiamo anche rilevato una ridotta attività FAK, senza alterazioni nei livelli di espressione FAK, nelle cellule tumorali del pool PANC-1 CAP1-knockdown (Fig. 7B). Sulla base di questi risultati, abbiamo ulteriormente testato gli effetti della deplezione di CAP1 sull’adesione cellulare in saggi di adesione, in modo simile come abbiamo eseguito in precedenza12,18. Abbiamo trovato che il CAP1-knockdown cellule pool derivate da entrambi i costrutti shRNA aveva notevolmente ridotto l’adesione delle cellule rispetto alle cellule di controllo (Fig. 7C). In entrambi i punti di tempo (45 minuti e 2 ore) dopo che le cellule erano state placcate sulla superficie rivestita di fibronectina, significativamente più cellule di controllo attaccato rispetto alle cellule CAP1-knockdown pool. Inoltre, più delle cellule di controllo attaccate si erano anche completamente diffuse (sviluppate lamellipodia e le cellule non mostrano come luminoso) rispetto alle cellule CAP1-knockdown (Fig. 7C). Abbiamo segnato il numero di cellule attaccate da tre campi per il confronto, e i dati da tre esperimenti indipendenti sono stati quantificati come tracciato nel grafico (Fig. 7D).