Tra i frammenti di DNA che inizialmente abbiamo cercato di amplificare, solo tlp2, che1P e cheA1 (Tabella 1) hanno prodotto un prodotto di amplificazione PCR senza l’uso di additivi solventi, quando il DNA genomico di A. brasilense è stato usato come template (Figura 1). Gli effetti di DMSO a 1,25%, 2,5%, 5,0%, 7,5%, e 10%, (w/vol) così come la formamide a concentrazioni simili come additivi nella PCR sono stati testati per la prima volta (Figura 1). Una serie di PCR è stata eseguita anche con BSA a 1-10 μg/μl (dati non mostrati). Coerentemente con i dati della letteratura, mentre sia DMSO o aggiunta di formammide in PCR promosso aumentato rendimento di amplificazione di frammenti di DNA di 2-3 kb, l’effetto di miglioramento di DMSO era maggiore di quello di formammide (Figura 1). In queste condizioni, abbiamo anche osservato che aumentando la concentrazione di DMSO potrebbe anche portare alla diminuzione della specificità della PCR (Figura 2). D’altra parte, l’effetto della formamide nel promuovere un aumento della resa della PCR è diminuito per frammenti di DNA più grandi di circa 2,5 kb (Figura 1). Non c’è stato alcun effetto significativo dell’aggiunta di BSA da solo come additivo della PCR, in queste condizioni, incluso nessun effetto dannoso (Dati non mostrati). Gli effetti migliorativi della BSA sulla resa della PCR sono stati rilevati quando è stata usata in combinazione con DMSO o formammide, su una vasta gamma di dimensioni dei frammenti di DNA (Figura 2). Inoltre, l’aggiunta di BSA ha ampliato la gamma di concentrazioni per cui il solvente organico potrebbe essere aggiunto, anche per i modelli di DNA di dimensioni maggiori (Figura 2). Il consenso della letteratura attuale sulla formamide indica che è più efficace come additivo PCR quando viene utilizzato a concentrazioni che vanno dallo 0 al 5%, con l’efficacia che cade completamente al 10%. I nostri risultati indicano che in presenza di BSA, la formamide è efficace almeno fino a concentrazioni del 10% e con modelli di DNA fino a 2,5 kb di dimensioni (tlp2); tuttavia, non è riuscito a promuovere l’amplificazione di frammenti di DNA di dimensioni maggiori (Figura 1). Questo risultato è coerente con l’effetto segnalato di formamide come più efficiente per amplificazioni di DNA template fino a circa 2,5 kb e sostenere ulteriormente la nozione che DMSO e formamide migliorato rendimenti PCR da diversi meccanismi (s). Indipendentemente da queste differenze, l’aggiunta di BSA a questa PCR sembra promuovere ed espandere ulteriormente gli effetti benefici osservati quando uno dei due solventi è stato usato come additivo della PCR. Dati i potenziali effetti negativi che alte concentrazioni di solventi organici possono avere su applicazioni sensibili a valle come il sequenziamento o la clonazione, l’effetto di miglioramento dell’aggiunta di BSA è significativo. Al fine di ottenere informazioni su come BSA potrebbe agire come un co-enhancer con DMSO o formamide, analizziamo l’effetto della sua aggiunta sulla resa di amplificazione su 10, 15, 20, 25 e 30 cicli di PCR. Questa analisi ha confermato che l’aggiunta di DMSO o formammide, ma non di BSA da sola, alla PCR porta ad un aumento della resa (Figura 3). Quando la BSA è stata utilizzata come co-enhancer con DMSO o formammide, un aumento della resa potrebbe essere rilevato nei primi 15 cicli solo per tutti i modelli (Figura 3). Questo aumento variava da un 10,5% (che1P) aumento del rendimento a un 22,7% aumento del rendimento (cheA1) nel corso dei primi 15 cicli. Inoltre, la concentrazione effettiva di BSA è stato trovato per aumentare con la dimensione del frammento di DNA amplificato fino a una concentrazione massima BSA (10 μg /μl) dove non è stato rilevato alcun ulteriore aumento della resa. Inoltre, nessuna diminuzione della resa è stata osservata anche con la massima concentrazione di BSA aggiunta in queste condizioni (Figura 4). L’effetto di miglioramento limitato al ciclo della BSA sulla resa della PCR ha suggerito che questa proteina può diventare denaturata nel tempo, perdendo così la sua efficacia. Per testare questa ipotesi è stata impostata una PCR in cui DMSO o formammide è stato combinato con BSA nel buffer di reazione iniziale alle concentrazioni più efficaci determinate sopra, e ha funzionato per 10 cicli prima di aggiungere una soluzione fresca di BSA (0-10 μg/μl concentrazione finale). L’aggiunta di BSA è stata ripetuta per 30 cicli di PCR e l’effetto sulla resa è stato analizzato come descritto sopra. Un aumento sostenuto della resa potrebbe essere rilevato quando BSA è stato aggiunto ad ogni decimo ciclo di PCR: per esempio, nell’amplificazione di cheA1, è stato ottenuto un aumento di quasi il 75% della resa di PCR rispetto a quella ottenuta con il solo solvente (Figura 4). I risultati visti in quello che noi chiamiamo il metodo “BSA PCR step” sono coerenti con l’ipotesi che la denaturazione del BSA causa il calo dell’effetto di miglioramento della resa dopo il quindicesimo ciclo di PCR. Gli esperimenti di controllo in cui il glicerolo o l’acqua distillata sterile sono stati aggiunti ad ogni decimo ciclo non hanno aumentato la resa della PCR, indicando che gli effetti della BSA non sono dovuti ad un cambiamento nel volume di reazione o alla BSA che agisce effettivamente come un affollatore molecolare, una proprietà attribuita ad alcuni degli effetti del glicerolo nella PCR. Mentre i meccanismi esatti dell’effetto di miglioramento della BSA sulla resa della PCR non sono noti, i dati ottenuti qui e descritti nella letteratura supportano l’ipotesi che la BSA possa stabilizzare la DNA polimerasi e/o contrastare i potenziali effetti inibitori di alte concentrazioni di solventi organici sull’attività della DNA polimerasi. Per l’amplificazione di cheA4, il frammento di DNA con il più alto contenuto di GC utilizzato in questo studio (73%), un aumento della resa della PCR è stato ottenuto aggiungendo BSA così come DMSO alla PCR, ma sono stati rilevati anche molteplici prodotti di amplificazione non specifici (Figura 5). Per risolvere questo problema, il metodo della fase di PCR con BSA è stato utilizzato in combinazione con un protocollo di PCR “Touchdown” che ha precedentemente dimostrato di migliorare la specificità della PCR. Questo metodo ha prodotto una singola banda specifica, e ha quasi raddoppiato il rendimento che è stato prodotto utilizzando il protocollo “Touchdown” più solventi organici da solo (96% di aumento) (Figura 5). Questi risultati ci hanno anche suggerito un modo per migliorare l’efficienza relativamente bassa di usare il metodo di mutagenesi sito-diretto su plasmide intero descritto nel kit di mutagenesi QuickChange Stratagene (Stratagene) per introdurre la mutazione in alcuni modelli di DNA ricchi di GC (qui il gene tlp2, un frammento di 2,5 kb di 66% GC). Quando abbiamo usato il pUCtlp2 come template per la mutagenesi sito-diretta, insieme a primer mutageni progettati per introdurre una sostituzione singola coppia di basi all’interno tlp2 (primer mutageni progettati per sito web del produttore) e il protocollo del produttore, il frammento 5,324 kb corrispondente a pUCtlp2 era appena visibile (Figura 5). Dopo aver completato il protocollo di mutagenesi secondo le istruzioni del produttore, o nessuna colonia o un piccolo numero di colonie (meno di 5 in media) che conteneva plasmidi parentali che mancava la mutazione desiderata sono stati ottenuti. Questo tipo di risultato, caratterizzato da una scarsa resa di mutagenesi, è stato precedentemente riconosciuto come una trappola comune di questo metodo. Tuttavia, quando BSA è stato integrato al buffer del produttore ogni cinque passi, un prodotto di amplificazione chiaramente è stato rilevato (Figura 5). Al completamento del protocollo del produttore, sono state ottenute oltre 100 colonie con 2/3 portatori della mutazione desiderata (determinata dal sequenziamento). Abbiamo anche applicato il passo BSA PCR in un protocollo di estensione di sovrapposizione per costruire una fusione proteica chimerica tra un gene A. brasilense (ATM, 650 bp) e la proteina fluorescente ciano (CFP) (720 bp). Nella PCR di estensione della sovrapposizione, 2 set di coppie di primer vengono prima utilizzati per amplificare due frammenti di DNA da fondere che sono prodotti con una breve sequenza sovrapposta l’uno all’altro. Una terza amplificazione utilizza i prodotti di amplificazione delle prime reazioni come template, insieme ai primer reverse e forward più esterni per generare costrutti chimerici. L’amplificazione dei due frammenti iniziali di DNA, ATM e CFP sono stati molto efficienti utilizzando protocolli PCR standard e nessun aumento significativo potrebbe essere ottenuto utilizzando il protocollo BSA PCR Step (Dati non mostrati). Tuttavia, il secondo passo di sovrapposizione della PCR ha prodotto numerosi prodotti di amplificazione aspecifici e poco, se non nessuno, l’amplicone chimerico desiderato (ATM-CFP; Tabella 1) (Figura 5). I prodotti di amplificazione aspecifici sono scomparsi, quando si utilizza un metodo PCR “Touchdown”, ma l’amplicone chimerico specifico desiderato è rimasto in quantità molto bassa, come rilevato da una banda ATM-CFP molto debole di 1.370 bp (Figura 5). Utilizzando il metodo BSA PCR Step insieme al protocollo “Touchdown”, si è ottenuto un aumento del 72% nella resa dell’amplicone chimerico ATM-CFP (Figura 5). Il successivo clonaggio e il sequenziamento hanno confermato che è stato ottenuto il costrutto chimerico corretto.
Effetti di DMSO e formamide sull’amplificazione PCR di modelli ricchi di GC. Esempi tipici degli effetti dell’aggiunta di DMSO e formammide a diverse concentrazioni sull’amplificazione PCR di modelli di DNA ricchi di GC da 2-3 kb. A) Effetto di DMSO su amplificazione PCR di che1P (in alto) e tlp2 (in basso) come osservato da gel elettroforesi di prodotti totali PCR. I gel sono stati colorati con bromuro di etidio e fotografati. B) Effetto della formamide sull’amplificazione PCR di che1P (in alto) e tlp2 (in basso) in esperimenti comparabili.
Effetto di miglioramento della resa PCR della BSA usata come co-additivo con solventi organici. Esempi tipici degli effetti della BSA come co-additivo con DMSO e formammide, a diverse concentrazioni, sull’amplificazione PCR di modelli di DNA ricchi di GC. A) Effetto di DMSO su PCR di che1P (a sinistra) e l’effetto combinato di DMSO con 6 μg/μl BSA (a destra) come osservato da gel elettroforesi del prodotto totale PCR. B) Effetti della formamide sull’amplificazione PCR di che1P (a sinistra) ed effetto combinato della formamide con 6 μg/μl BSA (a destra) in esperimenti comparabili.
Effetto dell’aggiunta di BSA come co-enhancer con solventi organici sulla resa PCR. L’aumento della resa della PCR è espresso rispetto alla resa della PCR ottenuta senza alcun additivo. Su tutti i pannelli, si applica la seguente legenda: linea rossa, DMSO (7,5%) solo; linea verde, formamide (2,5%) solo; linea viola, DMSO (7,5%) e BSA (6 μg/μl); azzurro, formamide (2,5%) e BSA (6 μg/μl). A) Amplificazione PCR di che1P (392 bp); B) Amplificazione PCR di tlp5P (798 bp); C) Amplificazione PCR di tlp2 (2.638 bp); D) Amplificazione PCR di cheA1 (3.389 bp); E) Amplificazione PCR di cheOP1 (7.103 bp).
Effetto della BSA come co-additivo con solventi organici quando viene aggiunta a passi intermedi della PCR. A) Effetto dell’aggiunta di BSA sulla resa della PCR quando aggiunto ogni dieci cicli per frammenti di DNA di ampio range di dimensioni (da 392 bp a 7.103 bp); B) Esempio rappresentativo dell’effetto dell’aggiunta di BSA sull’amplificazione PCR di cheA1 (3.389 bp) in presenza di DMSO, come rilevato dall’analisi dei frammenti di DNA amplificati mediante elettroforesi su gel.
Effetto della BSA come co-additivo con solventi organici in varie applicazioni PCR. A) Un esempio rappresentativo dell’effetto dell’aggiunta di BSA (BSA Step) come coadiuvante dell’effetto del DMSO sull’amplificazione PCR di cheA4 in un protocollo PCR “Touchdown”, come rilevato dall’elettroforesi del gel. B) Un esempio rappresentativo dell’effetto del protocollo BSA Step utilizzato nella mutagenesi sito-diretta (QuickChange site-directed mutagenesis, Stratagene) amplificazione PCR di pUCtlp2, come rilevato da gel elettroforesi. C) Un esempio rappresentativo dell’effetto del protocollo BSA Step utilizzato in un’applicazione PCR di estensione di sovrapposizione, che fonde ATM con CFP per produrre ATM-CFP, come rilevato dall’elettroforesi del gel.