RISULTATI E DISCUSSIONE
I parametri di qualità dell’acqua – temperatura (28.2 ±0,2 ºC), ossigeno disciolto % (107,4±0,8), pH (7,9 ± 0,1), azoto ammoniacale totale (2,8 ± 0,0mg.L-1), ammoniaca non ionizzata (0,004 ± 0,001mg.L-1) nitrito-azoto (0.08±0.01mg.L-1) e nitrato-azoto (1.19±0.06mg.L-1) – sono stati considerati appropriati per il benessere e lo sviluppo naturale dei pesci (Boyd, 1990).
L’ossido di cromo è il marker inerte più ampiamente utilizzato negli studi sulla nutrizione con gli animali, e i mangimi permettono la sua valutazione e la formulazione precisa di diete bilanciate. Il recupero completo del Cr3+ in forma di ossido è stato confermato attraverso la tecnica degli isotopi radioattivi (Kane et al., 1959) e per questo motivo è stato utilizzato in questo studio, come 51Cr2O3 (purezza 99,99%).
Il 51Cr è stato utilizzato in questo studio per evitare possibili errori dovuti al recupero del cromo nei mangimi, nell’acqua dell’acquario, nelle feci e nei campioni di tessuto nei pesci, poiché permette una lettura elementare diretta, semplice, sensibile e più accurata, nel materiale campione, riducendo i bias associati alle analisi chimiche, soprattutto negli studi di digeribilità e nutrizione. Tutti questi fattori sono stati attentamente monitorati e controllati in questo studio in modo che i risultati potessero essere accreditati esclusivamente agli effetti del trattamento. La tabella 2 mostra i risultati, la deviazione standard e i parametri di regressione stabiliti dopo la trasformazione logaritmica delle attività specifiche di 51Cr rilevate nei campioni raccolti dai pesci di controllo e sperimentali, in funzione del tempo (giorni) di raccolta. Le regressioni sono state confrontate attraverso i coefficienti angolari e lineari (Ostle e Mensing, 1975).
Tabella 2. Trasformazione logaritmica delle attività specifiche rilevate del 51Cr nelle collezioni di campioni dei pesci di controllo e sperimentali e quelle che sono state utilizzate per regolare le curve di regressione.
| Campione raccolto | Giorno della raccolta | |||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | ||
| Pesci di controllo | ||||||||
| Sangue (BC) | 1.00±0.01A | 1.00±0,01 | 1.00±0.01 | 1.00±0.01 | 1.00±0.01 | 1.00±0.01 | 1.01±0.01 | |
| Pesci sperimentali | ||||||||
| Sangue (BE) | 1.00±0.01 | 1.00±0.01 | 1.00±0.01 | 1.00±0.01 | 1.00±0.01 | 1.00±0.01 | 1.01±0.01 | |
| Tessuto renale (RT) | 1.00±0.01 | 1.00±0.01 | 1.00±0.01 | 1.01±0.01 | 1.00±0.01 | 1.00±0.01 | 1.01±0.01 | |
| Tessuto muscolare – Filetto (MT) | 1.00±0.01 | 1.00±0.01 | 1.00±0.01 | 1.00±0.01 | 1.00±0.01 | 1.00±0.01 | 1.00±0.01 | 1.01±0.01 |
| Tessuto del fegato (LT) | 1.00±0.01 | 1.00±0.00 | 1.00±0.00 | 1.00±0.01 | 1.00±0.01 | 1.00±0.00 | 1.01±0.01 | |
| grasso viscerale (VF) | 1.00±0.01 | 1.00±0.01 | 1.00±0.01 | 1.00±0.01 | 1.00±0.01 | 1.00±0.01 | 1.00±0.01 | |
| Intestino senza contenuto (I) | 1,06±0.04 | 1.19±0.05 | 1.30±0.05 | 1.49±0,12 | 1,82±0,03 | 1,89±0,0,27 | 2,22±0,11 | |
| Stomaco senza contenuto (S) | 1,05±0,03 | 1,20±0,06 | 1.22±0.04 | 1.33±0.10 | 1.56±0.21 | 1.92±0.27 | 2.19±0.03 | |
| Tessuto branchiale (GT) | 1.06±0.03 | 1.10±0.03 | 1.20±0.02 | 1.33±0.05 | 1.45±0.09 | 1.66±0.11 | 1.85±0.05 | |
| acqua dell’acquario (WA) | 1.04±0.06 | 1.27±0.04 | 1.48±0.03 | 1.62±0.04 | 1.74±0.03 | 1.83±0.03 | 1.87±0.06 | |
| Contenuto del tratto digestivo (feci) (CTDE) | 1,18±0,08 | 1.81±0.38 | 2.60±0.28 | 3,75±0.24 | 4,26±0.31 | 5.07±0.15 | 5.83±0,04 | |
AValeus sono media (deviazione standard) di cinque ripetizioni.
Per indagare se c’è assorbimento di cromo III nel pesce, come l’ossido di cromo, regressioni lineari semplici sono stati regolati – giorni di raccolta vs coefficienti di determinazione per i campioni del controllo e pesce sperimentale (Figura 1). I valori di fondo misurati per i campioni di tessuto di pesce che non hanno ricevuto la dieta sperimentale, 10.000 conteggi in cinque intervalli, erano in media 98,02±3,61cpm, e sono stati sottratti da tutti i valori di lettura dei campioni di pesce di controllo e sperimentali.
Figura 1. Regressioni lineari aggiustate dopo la trasformazione logaritmica delle stime dell’attività radioattiva (cpm) delle raccolte di campioni dei pesci di controllo e sperimentali in funzione del tempo (giorni) di esposizione.
L’assorbimento intestinale del cromo trivalente (per esempio cloruri, fluoruri, fosfati, nitrati e idrossidi), è basso sia negli esseri umani che negli animali, variando tra circa 0,5 e 2,0% a seconda dell’assunzione alimentare. Alcuni dati indicano che l’assorbimento del cromo è inversamente correlato alla sua assunzione con la dieta (Anderson e Kozlovsky, 1985). In questo esperimento, il livello di ossido di cromo aggiunto alla dieta era solo lo 0,01% e secondo gli autori sopra citati, a questo piccolo tasso il cromo porterebbe ad un maggiore assorbimento da parte del tratto digestivo e quindi sarebbe più facilmente rilevabile nei campioni di pesce sperimentale.
Le regressioni aggiustate per i campioni di sangue dei pesci alimentati con la dieta di controllo per sette giorni, animali di controllo, quando confrontate con la regressione aggiustata con campioni di pesci alimentati con la dieta sperimentale non differiscono tra loro (P>0,05). Questi risultati concordano con quelli ottenuti da Utley et al. (1970), che hanno anche usato ossido di cromo radioattivo (III) per via orale, ma somministrato a bovini, e non hanno rilevato radiazioni nel sangue delle giovenche. Altri studi hanno riportato una rapida velocità di passaggio del 51CrCl3 attraverso il tratto gastrointestinale (Oberleas e Stoecker, 1987) e rapidi picchi di 51Cr nel sangue (Hopkins Junior, 1965) dei ratti e i livelli nel sangue riflettono l’assunzione di cromo (III). Pertanto, se l’ossido di cromo subisce l’assorbimento dal tratto gastrointestinale, la loro presenza dovrebbe essere rilevata rapidamente nel sangue dei pesci in questo studio.
Nel sangue, il cromo (III) assorbito è legato principalmente alla transferrina e ad altre proteine, che sono responsabili del suo trasporto nel corpo. L’immagazzinamento a lungo termine avviene in particolare nel fegato, nella milza, nelle ossa e in altri organi (Lim et al., 1983). I modelli di accumulo del cromo sono nel seguente ordine: rene > fegato > branchie H” muscolo, per concentrazioni più basse (Palaniappan e Karthikeyan, 2009).
Se il cromo sotto forma di marker inerte è stato assorbito dalla tilapia del Nilo, questo minerale viene accumulato nei tessuti del pesce. Pertanto, per determinare se c’era assorbimento di cromo come marcatore, attraverso il tratto digestivo della tilapia del Nilo, i campioni di sangue sono stati confrontati con regressione regolata da pesci di controllo, con regressione regolata campioni di grasso viscerale, tessuto epatico, tessuto muscolare e tessuto renale di pesci che hanno ricevuto la dieta sperimentale e quelli non differiscono tra loro (P>0,05), e quindi sono caratterizzati come appartenenti ad una singola regressione lineare. Questi risultati suggeriscono che non c’era radioattività rilevata nei campioni di pesce sperimentale, suggerendo nessun assorbimento significativo del marcatore.
Il meccanismo responsabile dell’assorbimento intestinale del cromo non è ben compreso. Non è chiaro se il Cr sia assorbito passivamente o con l’aiuto di proteine trasportatrici situate nella mucosa intestinale. Mertz et al. (1965) hanno riportato che l’assorbimento del Cr trivalente non sembra essere un processo saturabile, il che suggerisce che viene assorbito per diffusione passiva. Mertz e Roginski (1971) hanno riportato prove contrarie. Hanno trovato che la percentuale di cromo trivalente assorbita dalle sacche intestinali estroflesse diminuiva all’aumentare della concentrazione di Cr nel mezzo di incubazione. Questo effetto di saturazione osservato suggerisce che le proteine trasportatrici sono coinvolte nell’assorbimento del Cr. Tuttavia, nell’esperimento di Dowling et al. (1989) si è concluso che il cromo trivalente inorganico viene assorbito dal processo non mediato di diffusione passiva nell’intestino tenue dei ratti nutriti con una dieta adeguata al Cr.
Secondo i risultati ottenuti da Febel et al. (2001), il 2,5% di ossido di cromo è stato assorbito durante un’ora e il cromo assorbito è stato trasferito al fegato dove il tessuto epatico ha trattenuto il 10,9% di ossido cromico. Questi risultati differiscono dai risultati di questo studio, crediamo che sia perché non c’era un aumento significativo di cromo 51Cr nei tessuti dei pesci analizzati: sangue, grasso viscerale, fegato, reni e file di pesce, che non si sono verificati per suggerire l’assorbimento e conseguente bioaccumulo del marcatore. Ciò che differiva tra gli esperimenti era il sistema impiegato per mantenere le giuste condizioni di vita dei pesci nell’acquario, la concentrazione del marcatore aggiunto al cibo e le specie di pesci.
Una possibile spiegazione è che l’ossido cromico non è un marcatore inerte, e che c’è un sostanziale assorbimento di cromo, sotto forma di ossido cromico o altri derivati del cromo prodotti dalla digestione, attraverso la parete intestinale (Fernandez et al., 1999). Un’altra spiegazione, suggerita da Ng e Wilson (1997) per spiegare i risultati di Shiau e Liang (1995), è la possibile incorporazione attraverso le branchie dei pesci del cromo presente nell’acqua dell’acquario, derivante dall’espulsione da parte dei pesci delle feci contenenti cromo nell’acqua dell’acquario. Anche con un efficiente ricambio dell’acqua dell’acquario, la concentrazione di cromo aumenta, con conseguente assorbimento minerale (Fernandez et al., 1999).
In questo esperimento, con un sistema statico, gli acquari quotidiani sono stati sifonati per ridurre i residui ed evitare l’accumulo di mangime e feci nell’acqua e solo l’acqua persa per evaporazione e gestione veniva ripristinata. Questa procedura ha causato la concentrazione di cromo e la conduzione a un aumento lineare del minerale nell’acqua dell’acquario e nei campioni di branchie. L’accumulo varia con il periodo di esposizione e le concentrazioni ambientali. A bassa concentrazione, l’accumulo era in accordo con il tempo di esposizione (Palaniappan e Karthikeyan, 2009).
I metalli pesanti (ad esempio cobalto, rame, manganese, molibdeno, zinco e cromo) negli ambienti acquatici sono di preoccupazione critica a causa del loro accumulo negli organismi acquatici (Dimari et al., 2008). I pesci, essendo componenti principali della maggior parte degli habitat acquatici, sono stati anche riconosciuti come buoni bioaccumulatori di minerali inorganici (King e Jonathan, 2003). La branchia è stato anche segnalato come un sito importante per l’ingresso di metalli pesanti, che provoca lesioni branchie e danni (Bols et al., 2001). Per testare ulteriormente questa ipotesi, in questo esperimento, la concentrazione alimentare di 51Cr2O3 fornita nella dieta dei pesci sperimentali era di 100 µg.g-1, con un’attività specifica di 58,2 µCi. Pertanto, se l’elemento fosse stato assorbito dal tratto digestivo del pesce, forse attraverso l’incorporazione attraverso le branchie presenti nell’acqua dell’acquario o per qualsiasi altra via, almeno la radiazione gama, originata dal declino del 51Cr, dovrebbe essere stata rilevata nella tilapia del Nilo.
Quando le regressioni impostate, i campioni di sangue sono stati presi da pesci di controllo sono stati contrastati con quelli che rappresentano i risultati dei campioni raccolti dell’intestino senza contenuto, stomaco senza contenuto, contenuto del tratto digestivo dei pesci che hanno ricevuto la dieta sperimentale, e c’era un aumento lineare e differenze significative sono state rilevate tra le regressioni stabilite (P<0,05). Questi risultati ottenuti suggeriscono che l’intestino senza contenuto, senza contenuto dello stomaco e il contenuto del tratto digestivo hanno avuto un effetto di saturazione durante il periodo sperimentale di sette giorni.
I risultati ottenuti da Clawson et al. (1955) indicano che la concentrazione di ossido di cromo nelle feci entra in equilibrio con quella del mangime consumato tra tre e quattro giorni dopo la somministrazione iniziale di questo composto. Tuttavia, in questo studio, fino al settimo giorno c’è stato un aumento della concentrazione del marcatore nelle feci, questa differenza può essere dovuta alla bassa concentrazione del marcatore utilizzato in questo esperimento e la necessaria saturazione del tratto digestivo.
Considerando i risultati ottenuti in questo studio, siamo d’accordo con Fernandez et al. (1999), che un’altra possibile spiegazione per i risultati ottenuti da Shiau e Liang (1995) e Shiau e Shy (1998), sarebbe che il contenuto di cromo nei pesci segua lo stesso modello che hanno trovato per altri nutrienti inorganici (calcio, fosfato, ceneri), aumentando la sua concentrazione nei pesci alimentati con le diete integrate con ossido di cromo, con un massimo ad un livello di ossido di cromo intorno ai 5-10g.kg-1. Questo aumento potrebbe avere più a che fare con una maggiore ritenzione del cromo naturale presente nella dieta che con l’assorbimento dell’ossido cromico integrato. È stato riportato (Evtushenko et al., 1986) che il livello di metalli accumulati nei tessuti è rimasto invariabilmente ad un plateau anche quando gli organismi sono stati esposti ad essi continuamente per un periodo sufficientemente lungo.
Inoltre, i livelli del marker (dal 5 al 10% di ossido cromico incorporato nella dieta) utilizzati in questi studi, anche con un alto grado di purezza, possono fornire altre forme di complessazione del cromo che possono essere assorbite dal tratto digestivo o per altre vie dal pesce.