Mappatura del ruolo di MAP7 nella ramificazione collaterale dell’assone

I neuroni hanno morfologie dendritiche e assonali diverse e distinte. Il corretto sviluppo di queste strutture è vitale per la normale funzione e connettività. Infatti, una morfologia neuronale anormale è stata collegata a vari disturbi neurobiologici e psichiatrici (Luo e O’Leary, 2005). Lo sviluppo di diverse morfologie assonali dipende dalla capacità degli assoni in crescita di rispondere a spunti extracellulari. Questi spunti inducono un rimodellamento citoscheletrico localizzato per la rotazione e la ramificazione assonale (Armijo-Weingart e Gallo, 2017).

Lo sviluppo degli assoni nei neuroni sensoriali DRG è altamente stereotipato e quindi fornisce un buon modello per comprendere il meccanismo della ramificazione assonale. Questi assoni sensoriali si biforcano all’entrata nel midollo spinale, e gli assoni figli si estendono anteriormente o posteriormente. L’assone che cresce anteriormente salirà per trasmettere le informazioni sensoriali destinate al cervello. Inoltre, i rami ascendenti e discendenti dell’assone generano collateriali interstiziali che si formano da un asse stabilito per innervare lamine diverse lungo l’asse dorso-ventrale nel midollo spinale (Gibson e Ma, 2011).

Il recente lavoro di Tymanskyj et al. (2017) ha cercato di identificare le proteine che mediano la ramificazione assonale nei neuroni sensoriali DRG. Per farlo, hanno confrontato i profili trascrizionali dei neuroni DRG prima e dopo la formazione di rami collaterali. Poiché la proteina 7 associata al microtubulo (MAP7) è stata fortemente upregolata in seguito alla formazione del collaterale, gli autori hanno poi esaminato gli effetti della sovraespressione e del knockdown di MAP7 su colture di neuroni sensoriali primari raccolti nelle prime e nelle ultime fasi embrionali. La sovraespressione di MAP7 ha aumentato il numero di rami interstiziali nei neuroni più giovani che non esprimono tipicamente MAP7. Al contrario, l’abbattimento di MAP7 nei neuroni più vecchi coltivati dopo la formazione di rami in vivo ha portato a un minor numero di rami interstiziali in vitro. Questi esperimenti hanno dimostrato che MAP7 è sufficiente e necessario per la ramificazione interstiziale nei neuroni sensoriali.

Tymanskyj et al. (2017) hanno ragionato sul fatto che un regolatore della formazione dei rami probabilmente si localizza nelle regioni di un assone dove emergono i rami. Infatti, gli autori hanno trovato una forte preferenza per MAP7 nei punti di ramificazione. Poiché i rami nascenti si formano da filopodi che sono stabilizzati dalla penetrazione dei microtubuli, la tempistica della localizzazione di MAP7 nei punti di diramazione potrebbe suggerire il suo ruolo nel governare la tempistica e il modello della formazione dei rami. Gli autori hanno quindi eseguito l’imaging dal vivo e hanno determinato che MAP7 marcato con fluorescenza era assente nei filopodi pionieri, ma aveva un ingresso ritardato nei nuovi rami arricchiti di microtubuli. Un ulteriore lavoro ha scoperto che MAP7 si localizzava preferenzialmente in rami lunghi e stabili. Insieme, questi studi indicano che MAP7 è fondamentale per la maturazione dei rami, ma probabilmente non per la formazione iniziale dei rami.

Anche se queste manipolazioni in vitro hanno stabilito un ruolo per MAP7 nella ramificazione collaterale, gli autori hanno cercato di confermare questo utilizzando un mutante del topo in cui la proteina MAP7 è troncata al terminale C (MAP7mshi) (Turner et al., 1997). Il terminale C di MAP7 aveva precedentemente dimostrato di interagire con la chinesina (Sung et al., 2008; Barlan et al., 2013). Così, Tymanskyj et al. (2017) hanno ragionato che questo era il meccanismo per la ramificazione degli assoni e i neuroni MAP7mshi avrebbero avuto meno collateralità. Sorprendentemente, i neuroni sensoriali coltivati da topi MAP7mshi avevano un drastico aumento della ramificazione assonale rispetto ai neuroni degli animali di controllo. Questo, combinato con i precedenti risultati in vitro, implica fortemente che il termine N, e non il termine C, di MAP7 è vitale per promuovere la ramificazione collaterale degli assoni. Intrigante, se la terminazione C fosse dispensabile per promuovere la ramificazione, allora sarebbe ragionevole assumere che i neuroni MAP7mshi sarebbero simili ai neuroni di controllo; tuttavia, invece, la perdita della terminazione C di MAP7 risulta in un potenziamento della ramificazione collaterale. Una spiegazione è che un dominio C-terminale blocca la funzione N-terminale e la perdita del terminale C porta a una ramificazione esuberante. È anche possibile che il troncamento C-terminale produca livelli anormalmente alti di proteina MAP7 nei topi mutanti promuovendo la ramificazione assonale simile alla sovraespressione di MAP7 in vitro. Anche se Tymanskyj et al. (2017) hanno usato l’analisi in situ e RT-PCR per confermare la presenza dell’mRNA troncato negli animali MAP7mshi, i livelli di espressione comparabili di MAP7 non sono chiari. Quindi, il preciso ruolo regolatore del terminale C richiederà ulteriori studi.

Una scoperta chiave dagli animali MAP7mshi è venuta dall’analisi delle proiezioni dei neuroni sensoriali DRG. I neuroni sensoriali devono innervare correttamente sia i tessuti periferici di destinazione, come la pelle e il muscolo, che il midollo spinale, formando una serie di collateri assonici in entrambe le regioni per una sensibilità accurata agli stimoli esterni. È interessante notare che i topi MAP7mshi hanno esibito un maggior numero di collateri assonici che si ramificano nel midollo spinale rispetto agli animali di controllo, mentre il numero di collateri nella zampa anteriore era normale. L’innervazione aberrante degli assoni DRG nel midollo spinale nei topi MAP7mshi è stata associata a iperalgesia termica, suggerendo che i nocicettori DRG contano su MAP7 per la corretta formazione degli assoni. Se altri sottotipi di neuroni DRG richiedono MAP7 richiede ulteriori indagini. Anche se Tymanskyj et al. (2017) hanno coltivato una popolazione eterogenea di neuroni sensoriali da DRG dissociati, hanno integrato queste culture con fattore di crescita nervosa (NGF), che fornisce fattore trofico solo per un sottoinsieme di sottotipi neuronali (cioè, nocicettori) (Lallemend e Ernfors, 2012). Altri sottotipi neuronali DRG (ad esempio, propriocettori) non guadagnano supporto trofico da NGF e sono stati quindi esclusi da queste culture (Lallemend e Ernfors, 2012). Se sia i nocicettori che i propriocettori si affidano a MAP7 è particolarmente interessante perché proiettano a obiettivi diversi. In particolare, tuttavia, Tymanskyj et al. (2017) hanno scoperto che (1) solo un sottoinsieme di rami è emerso da una regione arricchita con MAP7, (2) solo un sottoinsieme di regioni arricchite con MAP7 lungo l’assone ha prodotto rami, e (3) i topi MAP7mshi avevano anomalie di ramificazione nelle proiezioni centrali ma non periferiche. Quindi, è probabile che altri fattori governino la formazione dei rami in questi assoni.

Un ampio lavoro ha dimostrato che gli spunti ambientali modellano la formazione dei rami dell’assone innescando una sequenza altamente regolata di eventi citoscheletrici, compresa la formazione di patch di actina, l’emergenza dei filopodi e la polimerizzazione e depolimerizzazione dei microtubuli (Armijo-Weingart e Gallo, 2017). Le proteine associate ai microtubuli (MAP) possono mediare i cambiamenti del citoscheletro influenzando positivamente o negativamente la stabilità e l’aggregazione dei microtubuli (Armijo-Weingart e Gallo, 2017). Simile al nuovo ruolo di MAP7 nella maturazione dei rami sensoriali, lavori precedenti hanno identificato un ruolo per MAP7 nella stabilità dei microtubuli delle cellule del Sertoli e nella spermatogenesi, dove l’assenza di MAP7 nei topi porta alla sterilità maschile (Komada et al., 2000; Magnan et al., 2009). Al contrario, Tymanskyj e altri (Tymanskyj et al., 2012; Barnat et al., 2016) hanno identificato MAP1B come un regolatore negativo della ramificazione e maturazione degli assoni nei neuroni corticali e DRG adulti. Questi lavori fanno luce sulla diversa cassetta degli attrezzi proteica disponibile per i programmi intrinseci di maturazione delle ramificazioni. Una domanda intrigante è cosa controlla la competizione tra regolatori positivi e negativi per mediare la costruzione o la distruzione dei rami.

I rami segregati localmente da un singolo neurone possono rispondere a spunti permissivi e/o restrittivi. Come accennato sopra, Tymanskyj et al. (2017) trovano che i topi MAP7mshi hanno una ramificazione collaterale aberrante nel midollo spinale, ma non nella zampa anteriore, suggerendo che questi rami divergenti rispondono a diversi spunti ambientali. Questa apparente restrizione della funzione MAP7 alla centrale, ma non periferica, ramificazione collaterale rispecchia la funzione unilaterale delle chinasi SAD nella centrale, ma non periferica, innervazione nei neuroni propriocettivi, un altro sottotipo di neurone sensoriale (Lilley et al., 2013). Lilley et al. (2013) propongono un modello in cui le chinasi SAD scolpiscono gli archi assonali attraverso esposizioni sequenziali di neurotrofine a lungo e breve termine. I neuroni propriocettivi ricevono un’esposizione tonica a lungo termine alla neurotrofina-3 da obiettivi periferici, come il muscolo, con conseguente upregolazione dell’espressione della chinasi SAD. Questa upregolazione innesca gli assoni per la programmazione intrinseca del ramo, ma questo percorso innescato viene attivato solo dopo l’esposizione di breve durata alla neurotrofina-3 dai neuroni bersaglio nel midollo spinale, come i motoneuroni, per indurre la ramificazione profusa nel midollo spinale ventrale (Lilley et al., 2013). Al contrario, il patterning degli assoni in altri sottotipi neuronali può essere governato da diversi spunti extracellulari. Per esempio, il sistema nervoso simpatico, un’altra popolazione neurotrofina-dipendente, risponde a due diversi spunti neurotrofici in fasi sequenziali durante la proiezione assonale. Gli assoni simpatici inizialmente crescono lungo i vasi sanguigni, un bersaglio intermedio, che secerne una neurotrofina che promuove l’estensione assonale (Kuruvilla et al., 2004). Tuttavia, al momento dell’innervazione finale, i terminali degli assoni sono esposti a NGF che è prodotto dal tessuto bersaglio. Target-derivato NGF induce un interruttore di segnalazione per fermare la crescita degli assoni e incoraggiare la ramificazione per consentire l’innervazione estesa del bersaglio (Suo et al., 2015). Forse la maturazione della ramificazione MAP7-dipendente si basa anche su (1) un singolo assone patterning cue con modelli temporalmente e localmente distinti o (2) diversi spunti sequenziali da obiettivi intermedi e finali.

I disturbi neurologici possono essere associati con alterato comportamento degli assoni e connettività cerebrale, contribuendo alla loro natura complessa e multifattoriale. Intrigante, MAP7 è espresso nel cervello embrionale del topo, e studi di mappatura genetica fine mostrano una significativa associazione nei polimorfismi a singolo nucleotide di MAP7 con la schizofrenia (Fabre-Jonca et al., 1998; Torri et al., 2010; Venkatasubramanian, 2015). Dopo le scoperte di Tymanskyj et al. (2017) nel sistema nervoso periferico, sarà fondamentale indagare la regolazione di MAP7 della maturazione dei rami assonali nel cervello per chiarire qualsiasi connessione tra MAP7 e schizofrenia. Inoltre, al di là dello sviluppo del sistema nervoso periferico, la ramificazione collaterale degli assoni è richiesta in tutto il sistema nervoso ed è fondamentale per un corretto cablaggio. Studi precedenti indicano che l’attivazione di programmi cellulari intrinseci che promuovono la polimerizzazione dei microtubuli può regolare positivamente la ricrescita degli assoni e la ramificazione dopo le lesioni (Ruschel et al., 2015). Pertanto, per discernere potenziali obiettivi terapeutici per la ricrescita degli assoni, le indagini future possono concentrarsi su MAP7 per riattivare la programmazione intrinseca dello sviluppo.