La prima parte di Rajskub fu come Oompa-Loompa in una produzione teatrale comunitaria di Willy Wonka & la Fabbrica di cioccolato, e il suo primo ruolo da protagonista fu Raggedy Ann. Nel 1996 è apparsa nei video musicali per le canzoni “The Good Life” dei Weezer e “The New Pollution” di Beck.
Dal 1996 al 1998, ha avuto un ruolo ricorrente nella serie HBO The Larry Sanders Show come assistente alle prenotazioni Mary Lou Collins.
Il suo ruolo più notevole è quello dell’analista di sistemi del CTU Chloe O’Brian in 24, in cui è entrata nel 2003 all’inizio della terza stagione dello show. Il suo personaggio è stato un successo di pubblico e di critica ed è stato uno dei pochi membri del cast a tornare nella quarta stagione dello show. Dopo essere stata una guest star regolare per due stagioni, Rajskub è diventata un membro principale del cast nella quinta stagione dello show. Alla fine della serie, era la protagonista femminile, con un ruolo di primo piano secondo solo a Kiefer Sutherland. Il suo personaggio ha anche avuto l’onore di dire le ultime parole della serie nel finale della stagione 8. Rajskub e Sutherland sono apparsi brevemente come i loro 24 personaggi in un episodio del 2007, “24 Minutes”, della serie animata della Fox I Simpson. Nell’agosto 2013, è stato annunciato che avrebbe ripreso il suo ruolo di Chloe O’Brian nella serie limitata 2014 24: Live Another Day.
Rajskub era uno dei membri del cast originale di Mr. È apparsa in The Sketch Show di Kelsey Grammer su Fox Television, The King of Queens come personaggio di nome Priscilla, e in numerosi film tra cui Mysterious Skin, Legally Blonde 2, Sweet Home Alabama, Dude, Where’s My Car? Man on the Moon, Punch-Drunk Love, The Anniversary Party, Firewall, Little Miss Sunshine, video musicali per Beck, Weezer e Sheryl Crow, oltre ad aver interpretato una donna cieca nel film Road Trip.
Rajskub faceva parte di un duo comico (con Karen Kilgariff) chiamato Girls Guitar Club. Nel 2006, ha fatto un’apparizione cameo in “Partings”, il finale della sesta stagione di Gilmore Girls, dove ha interpretato una trobairitz in cerca della sua grande occasione. (Rajskub era precedentemente apparsa in Gilmore Girls come protagonista femminile in A Film by Kirk, un cortometraggio realizzato dal personaggio Kirk Gleason). Ha fatto volontariato come attrice con lo Young Storytellers Program. Ha un background educativo come pittrice, avendo frequentato il San Francisco Art Institute.
Rajskub è stata nominata due volte per uno Screen Actors Guild Award; una volta nel 2005, e di nuovo nel 2007 per Outstanding Performance by an Ensemble in a Drama Series. Ha recitato come guest-star nell’episodio “Prime Minister” di Flight of the Conchords nel ruolo di Karen, una fanatica di Art Garfunkel. Ha recitato come “Gail la lumaca” in un episodio di It’s Always Sunny in Philadelphia intitolato “The Gang Gives Frank an Intervention”, e ha ripreso il ruolo nel finale della nona stagione, “The Gang Squashes Their Beefs”, e nella tredicesima stagione “The Gang Beats Boggs: Ladies Reboot”. Nel 2009, è apparsa anche nel film Julie & Julia come Sarah, una delle amiche più strette di Julie Powell. Nel 2010, Rajskub eseguito stand-up su New York Stand Up Show di John Oliver. Nel giugno 2010, è apparsa nell’episodio “Lovesick” durante la seconda stagione della serie USA Royal Pains.
Da luglio a ottobre 2010, si è esibita nel suo spettacolo solista, Mary Lynn Spreads Her Legs, allo Steve Allen Theater di Los Angeles. Il recensore F. Kathleen Foley del Los Angeles Times ha scritto “questo titolo allegramente volgare riassume il tono generale, che è spesso spensieratamente osceno”. Lo spettacolo, scritto da Rajskub con l’aiuto del regista/sviluppatore Amit Itelman, è stato ispirato dalle esperienze di Rajskub con la gravidanza, il parto e la prima maternità.
Nel gennaio 2011, Rajskub guest-star nell’episodio “Our Children, Ourselves” nella seconda stagione di Modern Family della ABC. Nell’autunno del 2011, Rajskub è apparso nella sitcom di breve durata How to Be a Gentleman. Sempre nel 2011, la serie web di Rajskub, Dicki, ha iniziato ad andare in onda su My Damn Channel. Dicki si basa su una serie di persone che Rajskub è cresciuta nel Michigan e dintorni. Il personaggio del titolo è una donna di 40 anni che vive a casa con i suoi genitori, fa artigianato e prende sul serio la sua arte. Dicki è stata una delle serie web di maggior successo di My Damn Channel fino ad oggi. La prima stagione si è conclusa nel novembre 2011, ma una seconda stagione è attualmente in sviluppo. Rajskub si è esibita nell’edizione di giugno 2012 di Don’t Tell My Mother! (Live Storytelling), una vetrina mensile in cui le celebrità condividono storie vere che non vorrebbero mai che le loro madri sapessero. Attualmente conduce un podcast sul Nerdist Network chiamato Kickin’ it Mary Lynn Style.
Nel 2013, Rajskub è apparsa nella quarta stagione di Arrested Development in un ruolo silenzioso ma ben accolto come Heartfire, un personaggio Rajskub ha detto “parlare dal cuore, ma non usare alcuna parola”. Nello stesso anno Rajskub è apparsa anche nella web serie All Growz Up con Melinda Hill.
Rajskub è apparsa sul podcast TV Guidance Counselor di Ken Reid il 27 marzo 2015.
Nell’agosto 2016, Rajskub è apparsa al Festival Fringe di Edimburgo in 24 Hours With Mary Lynn Rajskub ed è stata ben accolta da fan e critica.
Nel 2017, Rajskub è apparsa nella prima stagione della serie Adult Swim Dream Corp LLC, interpretando il paziente 46 nell’episodio “Are You Down With OCD?”.
Nel 2018, Rajskub è apparsa in Night School al fianco di Kevin Hart, Tiffany Haddish, Rob Riggle, Taran Killam, Megalyn Echikunwoke, Al Madrigal, Anne Winters, Fat Joe, e Keith David.
Nel 2021, Rajskub ha pubblicato uno speciale comico di 49 minuti chiamato Mary Lynn Rajskub: Live from the Pandemic; può essere noleggiato o acquistato attraverso diversi servizi di video-on-demand.