Primo sviluppoModifica
Negli anni ’60, l’uso della microscopia elettronica a trasmissione per i metodi di determinazione della struttura era limitato a causa dei danni da radiazioni dovuti ai fasci di elettroni ad alta energia. Gli scienziati ipotizzarono che l’esame dei campioni a basse temperature avrebbe ridotto i danni da radiazioni indotti dai fasci. Sia l’elio liquido (-269 °C o 4 K o -452,2 °F) che l’azoto liquido (-195,79 °C o 77 K o -320 °F) furono considerati come criogeni. Nel 1980, Erwin Knapek e Jacques Dubochet pubblicarono un commento sui danni del fascio a temperature criogeniche condividendo le osservazioni che:
Cristalli sottili montati su pellicola di carbonio sono risultati da 30 a 300 volte più resistenti al fascio a 4 K che a temperatura ambiente… La maggior parte dei nostri risultati può essere spiegata assumendo che la crioprotezione nella regione di 4 K è fortemente dipendente dalla temperatura.
Tuttavia, questi risultati non erano riproducibili e le modifiche sono state pubblicate su Nature solo due anni dopo informando che la resistenza al fascio era meno significativa di quanto inizialmente previsto. La protezione ottenuta a 4 K era più vicina a “dieci volte per campioni standard di L-valina”, rispetto a quanto dichiarato in precedenza.
Nel 1981, Alasdair McDowall e Jacques Dubochet, scienziati dell’European Molecular Biology Laboratory, riportarono la prima implementazione di successo della crio-EM. McDowall e Dubochet vetrificarono l’acqua pura in un film sottile spruzzandola su un film di carbonio idrofilo che fu rapidamente immerso nel criogeno (propano liquido o etano liquido raffreddato a 77 K). Lo strato sottile di ghiaccio amorfo era spesso meno di 1 µm e un modello di diffrazione elettronica ha confermato la presenza di ghiaccio amorfo/vitreo. Nel 1984, il gruppo di Dubochet ha dimostrato il potere del crio-EM nella biologia strutturale con l’analisi di adenovirus tipo 2 vetrificato, batteriofago T4, virus della foresta di Semliki, batteriofago CbK e virus della stomatite vescicolare.
Premio Nobel 2017 per la chimicaModifica
Nel 2017, tre scienziati, Jacques Dubochet, Joachim Frank e Richard Henderson, sono stati insigniti del Premio Nobel per la chimica per aver sviluppato una tecnica che permette di visualizzare le biomolecole.
Potenziale rivale della cristallografia a raggi XModifica
Al 27 ottobre 2020 la cristallografia a raggi X è stata utilizzata per l’immagine di 150494 campioni biologici ed è la tecnica dominante nella microscopia biologica, con il Cryo-EM molto indietro a soli 6016.
Tuttavia, secondo Nature, i progressi nei rivelatori di elettroni diretti (spesso indicati come dispositivi di rilevamento diretto o DDD) presso l’Università di Cambridge e l’automazione della produzione di campioni da parte di SPT labtech ha portato a un aumento dell’uso in campo biologico, rendendo il Cryo-EM un potenziale rivale.
La risoluzione della cristallografia a raggi X è limitata dalla purezza del cristallo, e la creazione di questi campioni richiede molto tempo, impiegando fino a mesi o addirittura anni. Inoltre, alcune proteine sono difficili da cristallizzare. Anche se la preparazione del campione per il Cryo-EM è ancora laboriosa, non ha questi problemi in quanto osserva il campione nel suo “stato nativo”.
Secondo Proteopedia, la risoluzione mediana raggiunta dalla cristallografia a raggi X (al 19 maggio 2019) sulla Protein Data Bank è 2.05 Å, e la risoluzione più alta raggiunta su record (al 27 ottobre 2020) è 0,48 Å. Al 2020, la maggior parte delle strutture proteiche determinate da Cryo-EM sono a una risoluzione inferiore di 3-4 Å. Tuttavia, le migliori risoluzioni di Cryo-EM si avvicinano a 1,5 Å, rendendolo un discreto concorrente nella risoluzione in alcuni casi.