Nel nostro studio, abbiamo rilevato retrospettivamente la presenza di mutazioni CALR in una coorte di 524 pazienti JAK2 V617F-negativi che si sono presentati con sospetto clinico e/o di laboratorio di MPN con l’obiettivo principale di determinare il valore diagnostico di questo rilevamento. Durante il periodo osservato, le mutazioni CALR non erano state indagate di routine nei pazienti con sospetto di MPN nel nostro centro, poiché sono state scoperte solo di recente1,2. Al contrario, la mutazione JAK2 V617F è già stata analizzata di routine dalla sua scoperta nel 200520. Pertanto, i pazienti JAK2 V617F-positivi sono stati esclusi dallo studio. Una mutazione MPL è un reperto relativamente raro nei pazienti MPN ed è per lo più presente nei pazienti con ET o PMF21. Nel nostro laboratorio, il test MPL è stato incluso nell’algoritmo diagnostico nei pazienti con sospetto MPN solo recentemente e viene effettuato solo dopo aver escluso le mutazioni JAK2 V617F e CALR. Pertanto, lo stato MPL non è stato definito in tutti i nostri pazienti al momento del primo esame.
Il nostro centro è un ospedale medico universitario che serve un’area con circa 1.000.000 di abitanti ed è un centro di riferimento per i tumori ematologici. Tutti i pazienti inviati al reparto di ematologia sono stati prima valutati da medici generici senza una conoscenza dettagliata nel campo delle neoplasie ematologiche. Come presentato nella tabella 3, solo una parte dei pazienti indirizzati al reparto di ematologia aveva parametri clinici e/o di laboratorio patologici sospetti di MPN al momento del primo esame. Pertanto, la maggior parte dei pazienti che sono stati inviati al dipartimento di ematologia erano individui senza una neoplasia ematologica, poiché abbiamo determinato che 380 pazienti (380/524 = 72,5%) erano privi di MPN. A questi pazienti sono state diagnosticate alterazioni secondarie del contenuto del sangue periferico causate da diverse condizioni, come carenza di ferro, malattie infettive e infiammatorie, iposplenismo, tumori maligni, fumo, interventi chirurgici recenti, uso di corticosteroidi e ipossia cronica. Di conseguenza, il numero di pazienti CALR-positivi nella nostra coorte era basso. Abbiamo identificato il 4,4% dei pazienti sospettati di MPN come CALR positivi, la maggior parte dei quali ha ricevuto una diagnosi di ET o PMF. La maggior parte degli studi simili ha analizzato il numero di pazienti CALR-positivi con MPN confermato; pertanto, il numero di pazienti CALR-positivi era molto più alto, variando dal 12 a più del 20%22,23,24,25,26. Sulla base dei nostri dati, sarebbe utile migliorare l’approccio diagnostico ai pazienti con livelli aumentati di una o più linee di cellule del sangue, poiché nella maggior parte dei casi ciò non è causato da una neoplasia ematologica. I pazienti dovrebbero essere sottoposti a screening di routine per le cause più comuni di eritrocitosi secondaria, trombocitosi e leucocitosi, e l’emocromo dovrebbe essere ripetuto almeno una volta alle visite di controllo prima del rinvio al reparto di ematologia. I test genetici molecolari dovrebbero essere riservati ai pazienti con un alto sospetto di malattia ematologica clonale e non eseguiti in tutti i pazienti indirizzati al dipartimento di ematologia.
Le mutazioni CALR sono comunemente identificate nei pazienti JAK2 V617F-negativi con ET1,2. Nel nostro centro, solo una minoranza di pazienti CALR-positivi (7/23 = 30%) ha ricevuto una diagnosi di ET secondo i criteri WHO 2008 al momento del primo esame. La ragione principale è stata la relativa riserva verso l’esame del midollo osseo in pazienti con trombocitosi moderata e un basso rischio di complicazioni trombotiche. Tuttavia, questo significa che potremmo aver sottostimato il numero di pazienti con trombocitosi clonale. Confermando la presenza di mutazioni CALR, siamo stati in grado di diagnosticare retrospettivamente 9 pazienti con ET secondo i criteri WHO modificati per ET13. Anche se tutti questi pazienti sono stati seguiti presso il nostro reparto a causa dell’alto sospetto di trombocitosi clonale, è di grande beneficio prognostico e terapeutico essere in grado di confermare la diagnosi di ET con una procedura non invasiva come il test genetico-molecolare. Le mutazioni CALR sono quindi importanti segni distintivi diagnostici per l’ET come è stato confermato anche recentemente in letteratura27,28.
Tutti i pazienti con PMF sono stati diagnosticati secondo i criteri WHO al momento dell’esame presso il Dipartimento di Ematologia. L’identificazione della mutazione CALR ha confermato retrospettivamente la diagnosi, ma non ha avuto alcun impatto diagnostico o terapeutico diretto.
Il CML è un sottotipo di SMD/MPN e non strettamente MPN12. Le mutazioni CALR nei pazienti con CMML sono estremamente rare e non giocano un ruolo importante nella sua patogenesi. Uno studio di gruppo di Zamora et al. ha dimostrato che solo 1 su 174 pazienti con CMML ha presentato una mutazione CALR29. Il paziente nel nostro studio che è stato diagnosticato con CMML tipo uno e successivamente progredito a mielofibrosi potrebbe essere stato mal diagnosticato al momento del primo esame, come PMF e CMML condividere molte caratteristiche comuni, tra cui monocitosi e fibrosi del midollo osseo. In un recente studio di Hu et al., un’analisi più accurata ha permesso a molti pazienti con diagnosi di CMML di essere riclassificati come affetti da PMF, dimostrando che un’analisi più approfondita dovrebbe essere eseguita per fare una diagnosi accurata, soprattutto nei pazienti con biomarcatori molecolari tipici per ET/PMF11,30.
Sono state descritte più di 50 mutazioni frameshift CALR, e tutte si trovano nell’esone 9 del gene CALR. Ci sono due tipi principali di mutazioni CALR: tipo 1 (una delezione di 52 bp; p.L367fs*46) e tipo 2 (un’inserzione TTGTC di 5 bp; p.K385fs*47). Sulla base delle loro caratteristiche molecolari, altre mutazioni possono essere raggruppate come tipo 1 e tipo 231. Nel nostro studio, il tipo più comune di mutazione CALR era di tipo 1, che è coerente con i dati della letteratura2,16,32. Le mutazioni che non sono né di tipo 1 né di tipo 2 dovrebbero essere sottoclassificate come tipo 1-like o tipo 2-like, poiché questo può avere un impatto sul fenotipo clinico e, nel caso della PMF, anche sulla sopravvivenza17. Le mutazioni di tipo 1 e di tipo 2 nel nostro studio sono state definite utilizzando AGADIR15, un algoritmo di approssimazione statistica che calcola la propensione all’elica per le 31 sequenze uniche di aminoacidi che sono alterate dalle mutazioni CALR16. Questo algoritmo è stato utilizzato in studi simili e rappresenta uno strumento importante nella sottoclassificazione delle mutazioni CALR16,17. Sembra estremamente importante definire correttamente il tipo di mutazione CALR, poiché questo ha anche un impatto diagnostico. È noto che solo le mutazioni che portano a un frameshift + 1 (-1 + 2) del frame di lettura sono patogene6. Altre mutazioni CALR possono essere varianti germinali di CALR con un significato clinico sconosciuto. Nel nostro studio, mutazioni CALR non frameshift sono stati rilevati in due pazienti. Uno di questi pazienti è stato diagnosticato con trombocitosi reattiva al momento dell’esame presso il Dipartimento di ematologia ed è stato definito retrospettivamente come CALR-positivo. Un’analisi dettagliata ha confermato una mutazione missenso CALR che risulta nella sostituzione dell’acido glutammico con l’acido aspartico in posizione aminoacidica 398. La stessa mutazione è stata scoperta in un paziente con leucemia neutrofila cronica (CNL) definita dall’OMS in uno studio di Lasho et al. Il suo studio ha concluso che le mutazioni CALR che non risultano in una generazione di un C-terminus distinto sono suggestive di un diverso meccanismo patogenetico che potrebbe essere ancora sconosciuto33. Nel nostro studio, abbiamo supposto che il nostro paziente non ha sviluppato una mutazione CALR che implicherebbe una malattia ematologica clonale. Secondo l’anamnesi del paziente, l’esame clinico e i risultati di laboratorio, era soprattutto suggestiva una trombocitosi reattiva. Al momento della stesura di questo articolo, il paziente era in buona salute senza alcuna possibile complicazione associata alla malattia ematologica clonale.
Un altro paziente con una mutazione CALR non-frameshift è stato diagnosticato con MPN-U. Questo paziente portava una delezione germinale in-frame nel gene CALR (NM_004343.3 (CALR):c.1142_1144delAGG; p.(Glu381del)), che era già stato riconosciuto in un paziente sintomatico con MPN34. Anche se il motivo KDEL è stato conservato, la delezione di un aminoacido (p.(Glu381del)) ha portato all’alterazione della struttura secondaria della proteina così come la struttura tridimensionale, che ha portato alla conclusione della natura patogena di questa delezione in-frame23,34,35. Il nostro paziente con MPN-U ha purtroppo perso il follow-up e non è stato possibile definire una diagnosi ematologica esatta o eventuali complicazioni. Tuttavia, i risultati di laboratorio erano suggestivi di una malattia ematologica clonale.
Nel nostro studio, abbiamo scoperto quattro nuove mutazioni CALR nell’esone 9 che, a nostra conoscenza, non sono ancora state registrate nel database COSMIC (https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic) o HGMD (http://www.hgmd.cf.ac.uk). Il database COSMIC è il più grande database al mondo, curato da esperti, di mutazioni somatiche nel cancro umano. Descrive oltre 4 milioni di mutazioni codificanti36. Il database HGMD rappresenta un tentativo di raccogliere tutte le note (pubblicate) lesioni geniche responsabili di malattie ereditarie umane19. Le nuove mutazioni che sono state definite nel nostro studio sono NM_004343.3 (CALR):c.1127_1145del19, p.(Arg376Glnfs*48), NM_004343.3 (CALR):c.1154_1154delAinsGTTGTC, p.(Lys385Serfs*47), NM_004343.3 (CALR):c.1154_1154delAinsGTTTATC, p.(Lys385Ilefs*47), e NM_004343.3 (CALR):c.1132_1153del22, p.(Glu378Argfs*45). Tutte queste mutazioni erano mutazioni di tipo 2.
ET e PMF sono associate a un aumentato rischio di eventi trombotici e tromboembolici, che rappresentano importanti cause di morbilità e mortalità37. Ridurre il rischio di complicazioni trombotiche e tromboemboliche è uno degli obiettivi più importanti del trattamento, soprattutto nei pazienti con ET38. Questi pazienti sono anche a più alto rischio di complicazioni emorragiche, che possono essere legate a complicazioni del trattamento o alla sindrome di von Willebrand acquisita (AVWS) a causa della trombocitosi estrema (piastrine > 1000 × 109/L)28,39,40. Il rischio di trombosi nei pazienti con ET supera il 20%41. In uno studio svedese, il 35% dei pazienti con ET ha sviluppato complicazioni vascolari42. Nella PMF, gli eventi trombotici sono comuni come nell’ET43. La prevalenza delle complicazioni trombotiche nei pazienti con PMF varia dal 7 al 30%44,45,46. Nel nostro studio, la prevalenza di complicazioni trombotiche nei pazienti CALR-positivi era del 30%. Tuttavia, tre pazienti avevano sviluppato una complicazione trombotica più di 10 anni prima della diagnosi di MPN. La vera prevalenza delle complicazioni trombotiche nel nostro studio era quindi inferiore. Un paziente ha sviluppato un’emorragia vitreale che era il risultato di una terapia anticoagulante inadeguata con warfarin. Nessuno dei due pazienti con una complicazione emorragica aveva una trombocitosi estrema al momento della complicazione. Rispetto alle mutazioni JAK2 V617F e MPL, CALR è una mutazione favorevole ed è associata a una minore incidenza di eventi trombotici1,2,47. La maggior parte dei pazienti CALR-positivi che hanno sviluppato complicazioni trombo-emorragiche sono stati diagnosticati con mutazioni di tipo 1 (71,4%). Come già dimostrato, i pazienti con mutazioni di tipo 1 avevano un rischio maggiore di trombosi rispetto ai pazienti con mutazioni di tipo 210.
Le mutazioni CALR sono attualmente note per essere uno dei tre principali tipi di mutazione, oltre a JAK2 V617F e la mutazione MPL, nei pazienti con ET o PMF. Tuttavia, c’è ancora un 10-15% di pazienti con ET o PMF con un marcatore genetico molecolare sconosciuto alla base della malattia. Questi pazienti sono definiti “triplo negativi “48. In questi pazienti, sono stati ricercati nuovi biomarcatori molecolari attraverso il sequenziamento degli esoni codificanti nei geni del cancro mieloide, che ha mostrato risultati promettenti. Questo potrebbe fornire un approccio personalizzato alla diagnosi nei pazienti con MPN49.
Le mutazioni CALR nei pazienti MPN sono anche sotto esame per il loro potenziale terapeutico50,51,52. Le mutazioni dell’esone 9 di CALR potrebbero essere bersagli per la terapia immunitaria del cancro, in quanto hanno dimostrato di agire come neo-antigeni immunogenici51. Nel trattamento della MPN, potrebbe essere utile combinare i vaccini CALR con trattamenti immunomodulatori53 come l’interferone-alfa (IFN-α)54 o il ligando della morte programmata 1 (PD-L1)55 come una vaccinazione combinatoria del cancro53. Le mutazioni CALR, oltre ad essere importanti marcatori diagnostici e prognostici nei pazienti con MPN, potrebbero diventare in futuro un importante target terapeutico in un sottogruppo di pazienti con MPN.