Convexe Arrhenius plots en hun interpretatie

Abstract

Dit artikel vestigt de aandacht op geselecteerde experimenten met enzym-gekatalyseerde reacties die convexe Arrhenius plots vertonen, wat zeer zeldzaam is, en wijst erop dat Tolman’s interpretatie van de activeringsenergie een fundamentele model-onafhankelijke beperking plaatst op elke gedetailleerde verklaring van deze reacties. De hier gepresenteerde analyse toont aan dat in dergelijke systemen de snelheidscoëfficiënt als functie van de energie niet alleen langzamer toeneemt dan verwacht, maar zelfs afneemt. Deze interpretatie van de gegevens levert een beperking op voor voorgestelde microscopische modellen, d.w.z. dat elk succesvol model van een reactie met een convexe Arrheniusplot consistent moet zijn met de microcanonieke snelheidscoëfficiënt die een afnemende functie van energie is. De implicaties en beperkingen van deze analyse voor de interpretatie van enzymmechanismen worden besproken. Deze model-onafhankelijke conclusie is breed toepasbaar op alle gebieden van de kinetiek, en we vestigen ook de aandacht op een analogie met diffusie in metastabiele vloeistoffen en glazen.

Uit experimenten met reacties gekatalyseerd door een verscheidenheid van thermostabiele en mesostabiele dehydrogenase en oxidase enzymen is gebleken dat in sommige gevallen de Arrhenius plot voor de chemische stap convex is (20-23). In dit artikel geven wij commentaar op de betekenis van deze waarneming, en geven wij een interpretatie van deze bevinding die deze in het bredere perspectief plaatst van zowel de niet-biologische chemische als de biochemische kinetiek. Dit artikel wijst erop dat het convexe Arrhenius gedrag een ernstige beperking oplegt aan de microcanonieke unimoleculaire snelheidscoëfficiënt voor de chemische stap. In het bijzonder kunnen we verder gaan dan de voor de hand liggende interpretatie dat een convexe Arrhenius plot kan worden geïnterpreteerd als een lager dan verwachte snelheid bij hoge temperaturen, en kunnen we zeggen, onder bepaalde voorwaarden, dat de microcanonieke unimoleculaire snelheidscoëfficiënt voor de chemische stap in feite moet afnemen met toenemende energie.

In het algemeen is het wenselijk om de interpretatie van experimentele gegevens te scheiden in twee stappen. Eerst leiden we algemene consequenties af die rusten op solide fundamenten zoals thermodynamica en algemene principes van de statistische mechanica. Ten tweede gaan we over tot meer microscopisch gedetailleerde modellen die op minder zekere grondvesten rusten. Het nieuwe aspect van de huidige analyse heeft volledig betrekking op de eerste stap.

Het opvallende kenmerk van de reacties in refs. 20-23 die wij hier bespreken is de positieve convexiteit C van hun Arrhenius-kavels, waarbij 1 k(T) de katalytische snelheidscoëfficiënt is, en T de temperatuur. We schrijven 2 waarbij 3 Ea de temperatuurafhankelijke fenomenologische activeringsenergie is, en R de gasconstante. Een positieve convexiteit betekent dus dat Ea afneemt met toenemende temperatuur. In het brede veld van de kinetiek, waarbij de beschouwing niet beperkt blijft tot de enzymkinetiek, zijn niet-lineaire Arrheniusplots, wanneer zij kunnen worden waargenomen, bijna altijd concaaf, d.w.z. dat C negatief is. Dit algemene resultaat wordt verklaard door Tolmans interpretatie van de activeringsenergie, die kan worden geschreven als (25-27) 4 waarbij een dubbele bovenbalk een gemiddelde over alle reagerende systemen aangeeft, en een enkele bovenbalk een gemiddelde over alle systemen, ongeacht of zij reageren of niet. Met andere woorden, Tolman’s Eq. 4 stelt dat het negatieve van de lokale helling van een Arrheniusplot kan worden geïnterpreteerd als gelijk aan de gemiddelde energie van moleculen die reageren min de gemiddelde energie van alle mogelijke reactanten. Voor unimoleculaire reacties van een thermisch geëquilibreerde soort: 5 en 6 waarbij E de totale energie is, dP/dE de genormaliseerde kansdichtheid is dat een systeem energie E heeft in een canoniek ensemble bij temperatuur T, en k(E) de unimoleculaire snelheidscoëfficiënt is voor een microcanoniek ensemble bij energie E.§ Gewoonlijk neemt E̿ sneller toe dan Ē met toenemende T omdat k(E) gewoonlijk een toenemende functie van energie is.¶ Dit verklaart waarom Ea gewoonlijk met T toeneemt en waarom C dus negatief is. Een convexe Arrhenius-plot betekent dat E̿ afneemt of minder snel toeneemt dan Ē als de temperatuur toeneemt, en in de volgende paragraaf betogen we dat dit gewoonlijk inhoudt dat k(E) afneemt met toenemende energie over het energiegebied dat de integralen in Eq. 6 domineert.

Over het gevolg van het feit dat E̿ afneemt of minder snel toeneemt dan Ē als de temperatuur toeneemt, kan men een preciezere uitspraak doen. Door op te merken dat 7 waar β 1/RT is, en ρ(E) de dichtheid van toestanden, en door Eqs. 4-6 te gebruiken, kan men gemakkelijk aantonen dat 8 Dus de uitspraak dat dEa/dT negatief is, is hetzelfde als de uitspraak dat de verdeling van de reactie-energieën smaller is dan de verdeling van de reactantenergieën. Als dP/dE symmetrisch om Ē zou zijn, dan zou het teken van dEa/dT afhangen van de vorm van de functie k(E), en niet alleen van het teken. Maar dP/dE is in feite een sterk scheve functie. Voor typische moleculen wordt de vorm goed benaderd door ρ(E) in Eq. 7 gelijk te stellen aan En-1, waarbij n ongeveer gelijk is aan het aantal vrijheidsgraden (31). Als men deze vorm aanneemt en ook aanneemt dat k(E) langzaam en lineair varieert over het belangrijke bereik van de integralen in Eq. 6, kan men aantonen dat het rechterlid van Eq. 8 evenredig is met dk/dE met een positieve evenredigheidsconstante. Voor meer gecompliceerde k(E)-functies is er geen exacte evenredigheid meer, maar de richting van het effect wordt bepaald door de positieve scheefheid van dP/dE. Hoewel de identiteit van de tekens van dEa/dT en dk/dE geen wiskundig theorema is, wordt verwacht dat het geldt voor normale toestandsdichtheden en gladde k(E) functies.

Dit resultaat legt een beperking op aan elke microscopische interpretatie, en – even belangrijk – het suggereert nieuwe microscopische interpretaties. Stel bijvoorbeeld dat de configuratieruimte van de reactant kan worden verdeeld in twee soorten conformaties, waarvan de ene (type R genoemd) reactief is met snelheidscoëfficiënt kR(E) en de andere (type N genoemd) niet-reactief is met snelheidscoëfficiënt nul. Dan 9 waarbij PR(E) de voorwaardelijke kans is dat een systeem met energie E zich in een conformatie van type R bevindt. Dit levert een mechanisme op waardoor k(E) met E afneemt, d.w.z. PR(E) neemt sneller met E af dan kR(E) toeneemt. Dit zou kunnen gebeuren omdat hoger-energetische systemen een breder gebied van de faseruimte bezoeken en dus een kleinere fractie van hun tijd in een enkel beperkt gebied doorbrengen. Deze interpretatie kan van bijzonder belang zijn voor de enzymologie. De laatste jaren hebben verschillende studies zich beziggehouden met het begrijpen van de rol van conformatiebemonstering in de katalyse van enzymen (17, 18, 22, 32-37). In een recent overzicht betogen Bruice en Benkovic (17) dat de actieve configuraties die door het enzymatische complex worden bemonsterd, geen hogere energie hebben dan de algemene populatie van conformeren en dat het bevolken van deze conformaties de reactiesnelheid kan bepalen. In tegenstelling tot de soms gedetailleerde modellen in de geciteerde papers, gaat de huidige interpretatie uit van zeer algemene gronden zonder een beroep te doen op enig specifiek microscopisch moleculair mechanisme of model, zoals tunneling bevorderd door thermisch geëxciteerde enzymfluctuaties (11, 13, 38, 39), vrije energie van activeringsberekeningen inclusief een goede steekproef over conformaties (40), of specifieke mechanismen van overgangen tussen microstaten van variërende conformationele flexibiliteit (41-44). Niettemin kan het duidelijk ruimte bieden aan meer specifieke interpretaties zoals een eiwit dat stijf is bij lage T of een dynamische beweging die populatie van specifieke laag-energetische trillingstoestanden vereist. Niets van wat we hier gezegd hebben geeft echter specifieke steun aan zulke modellen, waarvan de geldigheid moet worden onderzocht door verdere experimenten en gedetailleerde simulaties. In de huidige discussie wordt niet specifiek verwezen naar effecten die samenhangen met het uiteenvallen van de overgangstoestandentheorie. Kwantumeffecten zoals tunneling kunnen worden ondergebracht door ze eenvoudigweg op te nemen in k(E) of kR(E).

In de context van onze analyse kunnen de hierboven genoemde resultaten voor thermofiel alcoholdehydrogenase ADH-hT (22, 32) worden geïnterpreteerd in termen van de relatieve trends in E̿ en Ē wanneer de temperatuur wordt gewijzigd. Een veelgehoorde hypothese is dat thermofiele enzymen geëvolueerd zijn om te functioneren in hun fysiologische niche, d.w.z. bij verhoogde temperatuur, en minder actief zijn bij kamertemperatuur (in sommige gevallen zelfs minder actief dan op grond van hun enthalpie van activering bij fysiologische temperatuur verwacht mag worden). Onze analyse kan een verband leggen tussen deze notie en berekeningen over de identificatie van actieve en niet-actieve conformaties (16, 17). Wrba et al. (21) rapporteerden bijvoorbeeld een empirische observatie dat, voor enzymen met verschillende smelttemperaturen, het verschil in de temperaturen van maximale kromming in Arrhenius plots vergelijkbaar is met het verschil in smelttemperatuur. Dit kan verband houden met verschuivingen in de PR(E)- en kR(E)-afhankelijkheden van E in de bereiken die belangrijk zijn bij de overgangstemperaturen voor denaturatie en activiteit. Als aanvullend voorbeeld merken wij op dat onlangs werd gesuggereerd dat het “misschien niet verrassend is dat, voor C-H-bond splitsingsreacties, een verdeling van thermische energie in laagfrequente eiwitmodes een belangrijke factor is. Deze modi kunnen aanzienlijk geëxciteerd raken bij omgevingstemperatuur, in tegenstelling tot de C-H strekkingsmodus, waarvan verwacht wordt dat hij grotendeels beperkt blijft tot zijn nulpuntenergieniveau” (22). Dit soort overwegingen kan in verband worden gebracht met de temperatuurafhankelijkheid van E̿ en Ē en dus met de concaviteit of convexiteit van Arrheniusplots.

De algemene conclusie over de energieafhankelijkheid van de microcanonieke snelheidscoëfficiënt is ook van toepassing op convexe Arrheniusplots die in andere studies af en toe worden waargenomen. Als men deze argumenten wil toepassen, moet men er zeker van zijn dat de convexe Arrheniusplot een echte elementaire reactie weergeeft met inwendig geëquilibreerde reactanten. Bijvoorbeeld, in het prototype steady-state probleem 10 waarbij 11 met 12 kan het worden toegepast op k1, k-1, of k2, maar in het algemeen niet op k. Als k-1 en k1 echter veel groter zijn dan k2, dan wordt k een elementaire snelheidscoëfficiënt voor A → C, en worden de conclusies niet gewijzigd door het pre-evenwicht vóór de snelheidsbepalende stap. Dit geldt verder voor het geval waarin k2 veel groter is dan k1 en k-1, waarin k k1 wordt. Een speciaal geval waarin de steady-state-benadering kan worden toegepast is dat waarin A overeenkomt met ongebonden reactant en enzym, toestand B het Michaelis-complex is, en toestand C het product (45). Merk op dat in dit geval k1 (in Eq. 12) een tweede-ordesnelheidsconstante moet zijn die leidt tot de Michaelis-vergelijking: 13 waarin de concentratie van de reactant (substraat) is, Vmax de reactiesnelheid is bij veel hogere waarden dan KM, die de Michaelis-constante is, (k2 + k-1)/k1, voor Eq. 10. De discussie is niet van toepassing op effectieve snelheidscoëfficiënten die het gevolg zijn van een verandering in de snelheidsbepalende stap of op veranderingen in de effectieve enzymconcentratie, en evenmin op snelheidscoëfficiënten met hysteresis die is toe te schrijven aan glasvorming. Dit punt moet worden benadrukt voor enzymatische reacties: vertegenwoordigen de gemeten snelheden werkelijk een zinvolle consistente snelheidsconstante over het gehele temperatuurbereik? In een vroeg rapport over een convexe Arrhenius-plot voor het thermofiele alcoholdehydrogenase van Bacillus stearothermophilus (ADH-hT) bijvoorbeeld, werden alle metingen uitgevoerd met dezelfde substraatconcentratie (die het enzym bij kamertemperatuur verzadigde), en werd Vmax gepresenteerd (47). In een later verslag (22) werd vastgesteld dat KM met de temperatuur toeneemt, zodat bij hoge temperatuur KM niet voldoende groter was dan KM, en de gemeten snelheid langzamer bleek te zijn dan Vmax, zodat een schijnbaar convexe Arrhenius-plot werd gepresenteerd. Zelfs voor de eenvoudigste realistische enzymkinetiek moet mechanisme 10 worden aangevuld met een stap voor het vrijkomen van het product, en moeten de gegevens worden geanalyseerd met de nodige aandacht voor de katalyse-inzet en de katalyseverhouding (48, 49); anders kan de gemeten kcat een andere temperatuurafhankelijkheid vertonen dan de intrinsieke k2. Refs. 20-24 zijn gekozen als voorbeelden waar bijzondere zorg werd besteed om te verzekeren en aan te tonen dat de Arrhenius-plot overeenkomt met één enkele snelheidsbeperkende elementaire chemische reactiestap als functie van de temperatuur. Rubach en Plapp (persoonlijke mededeling van ongepubliceerde resultaten), bijvoorbeeld, gebruikten stop-flow pre-steady state technieken om KIEs te meten op microscopische snelheidsconstanten om de reactie te bestuderen die gekatalyseerd wordt door paardenlever alcohol dehydrogenase. Zij vonden convexe Arrhenius plots voor zowel hydride als deuteride overdracht, maar geen temperatuursafhankelijkheid van de KIEs, en zij toonden aan dat geen verandering in de snelheidsbepalende stap waarschijnlijk hun resultaten zou beïnvloeden. Verder hebben we gevallen uitgesloten waarbij het temperatuurbereik onomkeerbaar gesmolten of gedeeltelijk gesmolten eiwit toelaat. In tegenstelling tot de enzymatische voorbeelden die convex Arrhenius gedrag vertonen waarbij een enkele elementaire stap betrokken is, noemen we het geval van huidpermeatie van geneesmiddelen, waarbij convex Arrhenius gedrag is waargenomen, maar waarbij de elementaire stappen niet zijn of kunnen worden uitgezocht (50, 51). Ter vergelijking met permeatie door de huid vermelden wij ook dat het iets beter gedefinieerde geval van niet-Arhenius temperatuursafhankelijkheid van diffusie in amorfe vaste stoffen is gemodelleerd door een multistep site-hopping model (52, 53).

Een voorbeeld uit de organische chemie geeft een nuttige illustratie van deze concepten in combinatie met een temperatuurafhankelijke structurele reorganisatie. Limbach heeft convexe Arrhenius-kavels waargenomen (persoonlijke mededeling van ongepubliceerde resultaten) voor de base-gekatalyseerde intramoleculaire protonoverdracht in 1,3-bis-(4-fluorofenyl)-triazeen opgelost in ethylmethylether . De snelheidscoëfficiënt is een gemiddelde over verschillende waterstofgebonden vormen van de reactant, met name het vrije molecuul en het complex met de base. De protonoverdracht vindt plaats in het complex. De bolle Arrhenius kromming is het gevolg van het feit dat het molecuul bij hoge temperatuur overgaat in de niet-gecomplexeerde vorm waar de barrière voor protonoverdracht groter is (ref. 55 en H. H. Limbach, persoonlijke mededeling). De Tolman-interpretatie is dus niet strikt van toepassing omdat de snelheidscoëfficiënt niet één enkele elementaire stap vertegenwoordigt. De Arrhenius-plot van de reactie van een van beide vormen afzonderlijk zou vermoedelijk quasilineair of concaaf zijn. Als de verschillende waterstofgebonden vormen echter worden beschouwd als conformers van één reactant, kan de Tolman-interpretatie worden toegepast, en dit levert een illustratie op van een molecuul dat langzamer reageert bij hogere energie omdat het een breder gebied van de faseruimte verkent dat in wezen niet-reactieve conformers omvat. Evenzo suggereren Massey et al. (23) een mogelijke verklaring van hun convexe Arrhenius-plot waarbij twee concurrerende enzymatische vormen betrokken zijn, die elk in een verschillend temperatuurgebied domineren. Dit model is een specifiek voorbeeld van een model dat consistent zou kunnen zijn met het hier gepresenteerde modelonafhankelijke resultaat. Voor niet-biologische reacties verwachten we dat bijzonder reactieve configuraties vaak hoogenergetische soorten zullen zijn. Het is mogelijk dat convexe Arrhenius plots vaker voorkomen in biologische systemen omdat een enzym specifiek zo kan zijn geëvolueerd dat de laagst-energetische toestanden (d.w.z. de meest toegankelijke bij omgevingstemperatuur T) de reactieve toestanden zijn, wat leidt tot lage E̿ zelfs als T wordt verhoogd.

Convexe Arrhenius plots zijn ook waargenomen voor diffusie in supergekoelde vloeistoffen en glazen. Dergelijke gevallen, zoals het bovengenoemde huidpermeatieprobleem, kunnen worden gecompliceerd door meerdere parallelle trajecten, maar zijn niettemin uitvoerig geanalyseerd. Een veel geciteerde verklaring is dat moleculen in vloeistoffen bij lage temperatuur diffunderen door merkbare potentiaalbarrières te overschrijden, terwijl bij hoge temperatuur de diffusieve bewegingen vrijwel vrij zijn (24, 56). Dit model erkent dat naarmate de temperatuur stijgt, de thermische energieën groter worden in vergelijking met de hoogte van de barrières; wat nodig is voor een convexe Arrheniusplot is dat de gemiddelde energie van moleculen die overgangen maken (in dit geval, diffusieve hoppen van het ene lokale minimum naar het andere) langzamer stijgt dan de gemiddelde energie van alle moleculen. Er zijn veel gedetailleerde theorieën van niet-Arhenius gedrag in metastabiele vloeistoffen en glazen die niet expliciet ingaan op de temperatuurafhankelijkheid van de activeringsenergie in termen van Tolman’s interpretatie (58), maar elke consistente verklaring van een convexe Arrhenius plot in termen van lokale evenwichtselementaire snelheidscoëfficiënten moet op een onderliggend niveau consistent zijn met Tolman’s resultaat, zelfs als dit niet expliciet is of zelfs niet wordt herkend.

Samenvattend heeft dit artikel gewezen op de fundamentele microcanonieke informatie die wordt verschaft door een waarneming van de convexiteit van de Arrheniusplot, maar die blijkbaar nog niet eerder is geïnterpreteerd. De analyse is wijdverbreid toepasbaar en doet een definitieve model-onafhankelijke voorspelling over gemiddelde energieën van systemen die overgangen maken. Het resultaat is relevant voor alle gebieden van de kinetica (in enzymen, in atmosferische chemie, in clusterreacties, enz.) waar convexe Arrhenius plots kunnen worden waargenomen, en daarom hebben we de presentatie zo algemeen mogelijk gehouden, terwijl we recente experimenten met thermostabiele en mesostabiele dehydrogenase en oxidase katalysatoren hebben aangehaald als specifieke voorbeelden waarin het fenomeen wordt vertoond. Wij hebben ook een verband gelegd met de diffusietheorie. Wij hopen dat het standpunt in dit artikel nieuwe manieren van denken over reactiesnelheden, katalyse en diffusie zal stimuleren.

• Ontvangen op 12 september 2000.