Wypukłe wykresy Arrheniusa i ich interpretacja

Abstract

Praca zwraca uwagę na wybrane eksperymenty dotyczące reakcji katalizowanych enzymatycznie, które wykazują wypukłe wykresy Arrheniusa, co jest bardzo rzadkie, i wskazuje, że interpretacja Tolmana dotycząca energii aktywacji nakłada fundamentalne, niezależne od modelu ograniczenie na jakiekolwiek szczegółowe wyjaśnienie tych reakcji. Przedstawiona tu analiza pokazuje, że w takich układach współczynnik szybkości w funkcji energii nie tylko rośnie wolniej niż oczekiwano, ale wręcz maleje. Taka interpretacja danych stanowi ograniczenie dla proponowanych modeli mikroskopowych, tzn. wymaga, aby każdy udany model reakcji z wypukłym wykresem Arrheniusa był zgodny z tym, że mikrokanoniczny współczynnik szybkości jest malejącą funkcją energii. Omówiono implikacje i ograniczenia tej analizy dla interpretacji mechanizmów enzymatycznych. Ten niezależny od modelu wniosek ma szerokie zastosowanie we wszystkich dziedzinach kinetyki, a także zwracamy uwagę na analogię z dyfuzją w metastabilnych cieczach i szkłach.

Doświadczenia na reakcjach katalizowanych przez różne termostabilne i mezostabilne enzymy dehydrogenazy i oksydazy wykazały, że w niektórych przypadkach wykres Arrheniusa dla etapu chemicznego jest wypukły (20-23). W niniejszej pracy komentujemy znaczenie tej obserwacji i przedstawiamy interpretację tego odkrycia, która umieszcza je w szerszej perspektywie niebiologicznej kinetyki chemicznej, jak również biochemicznej. W artykule wskazujemy, że wypukłe zachowanie Arrheniusa nakłada poważne ograniczenia na mikrokanoniczny, jednocząsteczkowy współczynnik szybkości dla etapu chemicznego. W szczególności, możemy wyjść poza oczywistą interpretację, że wypukły wykres Arrheniusa może być interpretowany jako niższa niż oczekiwana szybkość w wysokich temperaturach, i możemy powiedzieć, w pewnych warunkach, że mikrokanoniczny jednocząsteczkowy współczynnik szybkości dla kroku chemicznego musi faktycznie zmniejszać się wraz ze wzrostem energii.

Ogólnie, pożądane jest, aby rozdzielić interpretację danych eksperymentalnych na dwa kroki. Po pierwsze, wnioskujemy o ogólnych konsekwencjach, które opierają się na solidnych podstawach, takich jak termodynamika i ogólne zasady mechaniki statystycznej. Po drugie, przechodzimy do bardziej szczegółowych modeli mikroskopowych, które opierają się na mniej pewnych podstawach. Nowy aspekt obecnej analizy dotyczy w całości pierwszego kroku.

Uderzającą cechą reakcji w ref. 20-23, które tutaj omawiamy, jest dodatnia wypukłość C ich wykresów Arrheniusa, gdzie 1 k(T) jest współczynnikiem szybkości katalitycznej, a T jest temperaturą. Zapisujemy 2 gdzie 3 Ea jest zależną od temperatury fenomenologiczną energią aktywacji, a R jest stałą gazową. Zatem dodatnia wypukłość oznacza, że Ea maleje wraz ze wzrostem temperatury. W szerokiej dziedzinie kinetyki, nie ograniczając rozważań do kinetyki enzymatycznej, gdy można zaobserwować nieliniowe wykresy Arrheniusa, są one prawie zawsze wklęsłe, tzn. C jest ujemne. Ten ogólny wynik jest wyjaśniony przez Tolmana interpretacją energii aktywacji, która może być zapisana jako (25-27) 4 gdzie podwójny nawias oznacza średnią dla wszystkich reagujących układów, a pojedynczy nawias oznacza średnią dla wszystkich układów, niezależnie od tego czy reagują czy nie. Innymi słowy, równanie 4 Tolmana mówi, że ujemne lokalne nachylenie wykresu Arrheniusa może być interpretowane jako równe średniej energii cząsteczek, które reagują minus średnia energia wszystkich możliwych reagentów. Dla jednocząsteczkowych reakcji termicznie zrównoważonych gatunków: 5 i 6 gdzie E jest energią całkowitą, dP/dE jest znormalizowaną gęstością prawdopodobieństwa, że układ ma energię E w zespole kanonicznym w temperaturze T, a k(E) jest współczynnikiem szybkości jednocząsteczkowej dla zespołu mikrokanonicznego przy energii E.§ Zwykle E̿ rośnie szybciej niż Ē wraz ze wzrostem T, ponieważ k(E) jest zwykle rosnącą funkcją energii.¦ To wyjaśnia dlaczego Ea zwykle rośnie z T i stąd dlaczego C jest ujemne. Wypukły wykres Arrheniusa oznacza, że E̿ maleje lub wzrasta mniej gwałtownie niż Ē wraz ze wzrostem temperatury, a w następnym paragrafie argumentujemy, że zwykle oznacza to, że k(E) maleje wraz ze wzrostem energii w regionie energii, który dominuje w całkach w równaniu 6.

Można dokonać bardziej precyzyjnego stwierdzenia na temat konsekwencji tego, że E̿ maleje lub wzrasta mniej gwałtownie niż Ē wraz ze wzrostem temperatury. Zauważając, że 7 gdzie β jest 1/RT, a ρ(E) jest gęstością stanów, oraz korzystając z Równań 4-6, można łatwo pokazać, że 8 Zatem stwierdzenie, że dEa/dT jest ujemne jest tożsame ze stwierdzeniem, że rozkład energii reakcji jest węższy niż rozkład energii reagentów. Gdyby dP/dE było symetryczne względem Ē, to znak dEa/dT zależałby od kształtu funkcji k(E), a nie tylko od jej znaku. Ale dP/dE jest w rzeczywistości funkcją silnie skośną. Dla typowych molekuł, jej kształt jest dobrze przybliżony przez ustawienie ρ(E) w równaniu 7 równe En-1, gdzie n jest w przybliżeniu równe liczbie stopni swobody (31). Jeżeli przyjmiemy taką postać i założymy, że k(E) zmienia się powoli i liniowo w ważnym zakresie całek w równaniu 6, to możemy pokazać, że prawa strona równania 8 jest proporcjonalna do dk/dE z dodatnią stałą proporcjonalności. Dla bardziej skomplikowanych funkcji k(E) nie ma już dokładnej proporcjonalności, ale kierunek efektu jest ustalony przez dodatnią skośność dP/dE. Chociaż identyczność znaków dEa/dT i dk/dE nie jest twierdzeniem matematycznym, oczekuje się, że będzie ona obowiązywać dla normalnych gęstości stanów i gładkich funkcji k(E).

Ten wynik przedstawia ograniczenie na każdą mikroskopową interpretację i – co równie ważne – sugeruje nowe mikroskopowe interpretacje. Na przykład, załóżmy, że przestrzeń konfiguracji reagenta może być podzielona na dwa typy konformacji, z których jedna (zwana typem R) jest reaktywna ze współczynnikiem kR(E), a druga (zwana typem N) jest niereaktywna z zerowym współczynnikiem. Wtedy 9 gdzie PR(E) jest warunkowym prawdopodobieństwem, że układ o energii E znajduje się w konformacji typu R. To dostarcza mechanizmu, aby k(E) malało z E, tzn. PR(E) maleje z E szybciej niż kR(E) rośnie. Może to wynikać z faktu, że układy o wyższych energiach odwiedzają szerszy obszar przestrzeni fazowej i w związku z tym spędzają mniejszą część czasu w pojedynczym ograniczonym obszarze. Ta interpretacja może mieć szczególne znaczenie dla enzymologii. W ostatnich latach przeprowadzono szereg badań mających na celu zrozumienie roli próbkowania konformacyjnego w katalizie enzymatycznej (17, 18, 22, 32-37). W ostatnim przeglądzie, Bruice i Benkovic (17) argumentowali, że aktywne konfiguracje próbkowane przez kompleks enzymatyczny nie mają wyższej energii niż ogólna populacja konformerów i że populacja tych konformacji może determinować szybkość reakcji. W przeciwieństwie do czasami szczegółowych modeli w cytowanych pracach, obecna interpretacja opiera się na bardzo ogólnych podstawach bez odwoływania się do żadnego konkretnego mikroskopowego mechanizmu molekularnego lub modelu, takiego jak tunelowanie promowane przez termicznie wzbudzone fluktuacje enzymów (11, 13, 38, 39), obliczenia wolnej energii aktywacji obejmujące odpowiednią próbkę konformacji (40) lub specyficzne mechanizmy przejść pomiędzy mikrostanami o różnej elastyczności konformacyjnej (41-44). Niemniej jednak, może ona w oczywisty sposób pomieścić bardziej specyficzne interpretacje, takie jak białko, które jest sztywne w niskim T lub ruch dynamiczny, który wymaga populacji specyficznych niskoenergetycznych stanów wibracyjnych. Jednakże nic, co tutaj powiedzieliśmy nie daje konkretnego wsparcia dla takich modeli, których słuszność powinna być zbadana przez dalsze eksperymenty i szczegółowe symulacje. Niniejsza dyskusja nie odwołuje się specjalnie do efektów związanych z rozpadem teorii stanów przejściowych. Efekty kwantowe takie jak tunelowanie mogą być uwzględnione poprzez włączenie ich do k(E) lub kR(E).

W kontekście naszej analizy, wyniki wspomniane powyżej dla termofilnej dehydrogenazy alkoholowej ADH-hT (22, 32) mogą być interpretowane w kategoriach względnych trendów w E̿ i Ē przy zmianie temperatury. Szeroko rozpowszechniona hipoteza głosi, że enzymy termofilne ewoluowały do funkcjonowania w swojej niszy fizjologicznej, czyli w podwyższonej temperaturze, i są mniej aktywne w temperaturze pokojowej (w niektórych przypadkach nawet mniej aktywne niż przewidywana przez nie entalpia aktywacji w temperaturze fizjologicznej). Nasza analiza może oferować połączenie tego pojęcia z obliczeniami dotyczącymi identyfikacji aktywnych i nieaktywnych konformacji (16, 17). Na przykład, Wrba i wsp. (21) przedstawili empiryczną obserwację, że dla enzymów o różnych temperaturach topnienia, różnica w temperaturach maksymalnego zakrzywienia wykresów Arrheniusa jest podobna do różnicy w temperaturze topnienia. Może to być związane z przesunięciami zależności PR(E) i kR(E) od E w zakresach, które są istotne w temperaturach przejściowych dla denaturacji i aktywności. Jako dodatkowy przykład, zauważamy, że ostatnio zasugerowano, że „być może nie jest zaskakujące, że dla reakcji rozszczepiania wiązań C-H, podział energii termicznej na tryby białkowe o niskiej częstotliwości jest głównym czynnikiem. Tryby te mogą stać się znacząco wzbudzone w temperaturze otoczenia, w przeciwieństwie do trybu rozciągającego C-H, który powinien być w dużej mierze ograniczony do swojego poziomu energii punktu zerowego” (22). Tego rodzaju rozważania mogą być związane z zależnością E̿ i Ē od temperatury, a tym samym z wklęsłością lub wypukłością wykresów Arrheniusa.

Ogólny wniosek dotyczący zależności energetycznej współczynnika szybkości mikrokanonicznej ma również zastosowanie do wypukłych wykresów Arrheniusa, które są okazjonalnie obserwowane w innych badaniach. Jeśli ktoś ma zastosować te argumenty, musi być ostrożny, aby upewnić się, że wypukły wykres Arrheniusa reprezentuje prawdziwą reakcję elementarną z wewnętrznie wyrównanymi reagentami. Na przykład, w prototypowym problemie stanu ustalonego 10 gdzie 11 z 12 może to być zastosowane do k1, k-1, lub k2, ale nie ogólnie do k. Jednakże, jeśli k-1 i k1 są znacznie większe niż k2, wtedy k staje się elementarnym współczynnikiem szybkości dla A → C, i żadne wnioski nie są zmieniane przez wstępną równowagę przed krokiem wyznaczającym szybkość. Dotyczy to również przypadku, w którym k2 jest znacznie większe od k1 i k-1, gdzie k staje się k1. Szczególnym przypadkiem, w którym można zastosować podejście stanu ustalonego, jest sytuacja, w której stan A odpowiada niezwiązanemu reagentowi i enzymowi, stan B to kompleks Michaelisa, a stan C to produkt (45). Zauważmy, że w tym przypadku k1 (w równaniu 12) powinno być stałą szybkości drugiego rzędu, co prowadzi do równania Michaelisa: 13 gdzie jest stężeniem reagenta (substratu), Vmax jest szybkością reakcji przy znacznie większej niż KM, która jest stałą Michaelisa, (k2 + k-1)/k1, dla równania 10. Dyskusja ta nie dotyczy efektywnych współczynników szybkości wynikających ze zmiany etapu determinującego szybkość reakcji lub zmian efektywnego stężenia enzymu, ani współczynników szybkości z histerezą wynikającą z tworzenia się szkła. Ten punkt powinien być podkreślony dla reakcji enzymatycznych: czy zmierzone szybkości rzeczywiście reprezentują znaczącą stałą szybkości w całym zakresie temperatur? Na przykład, we wczesnym raporcie o wypukłym wykresie Arrheniusa dla termofilnej dehydrogenazy alkoholowej z Bacillus stearothermophilus (ADH-hT), wszystkie pomiary były prowadzone z tym samym stężeniem substratu (który nasycał enzym w temperaturze pokojowej), a Vmax zostało przedstawione (47). W późniejszym raporcie (22) stwierdzono, że KM wzrasta z temperaturą, więc w wysokiej temperaturze nie było wystarczająco większe niż KM, a zmierzona szybkość okazała się wolniejsza niż Vmax, przedstawiając pozornie wypukły wykres Arrheniusa. Nawet w przypadku najprostszej realistycznej kinetyki enzymatycznej, mechanizm 10 powinien być uzupełniony o etap uwalniania produktu, a dane powinny być analizowane z uwzględnieniem zaangażowania w katalizę i stosunku katalizy (48, 49); w przeciwnym razie zmierzone kcat może wykazywać inną zależność temperaturową niż nieodłączne k2. Jako przykłady wybrano prace 20-24, w których szczególną uwagę zwrócono na zapewnienie i wykazanie, że wykres Arrheniusa odpowiada pojedynczemu, ograniczającemu szybkość elementarnemu etapowi reakcji chemicznej w funkcji temperatury. Rubach i Plapp (komunikacja osobista niepublikowanych wyników), na przykład, wykorzystali techniki stanu ustalonego w przepływie zatrzymanym do pomiaru KIE na mikroskopijnych stałych szybkości w celu zbadania reakcji katalizowanej przez dehydrogenazę alkoholową wątroby końskiej. Znaleźli oni wypukłe wykresy Arrheniusa zarówno dla przenoszenia wodorków jak i deuterków, ale bez zależności KIE od temperatury, i wykazali, że żadna zmiana w kroku determinującym szybkość prawdopodobnie nie wpłynie na ich wyniki. Ponadto wykluczyliśmy przypadki, dla których zakres temperatur pozwala na nieodwracalne stopienie lub częściowe stopienie białka. W przeciwieństwie do przykładów enzymatycznych pokazujących wypukłe zachowanie Arrheniusa obejmujące pojedynczy elementarny krok, wspominamy przypadek przenikania leków przez skórę, gdzie zaobserwowano wypukłe zachowanie Arrheniusa, ale gdzie elementarne kroki nie zostały lub nie mogą być uporządkowane (50, 51). Dla porównania z przenikaniem przez skórę, wspominamy również, że nieco lepiej zdefiniowany przypadek nie-Arheniusa temperaturowej zależności dyfuzji w amorficznych ciałach stałych został wymodelowany przez wieloetapowy model site-hopping (52, 53).

Przykład z chemii organicznej dostarcza użytecznej ilustracji tych pojęć w połączeniu z zależną od temperatury reorganizacją strukturalną. Limbach zaobserwował wypukłe wykresy Arrheniusa (komunikat osobisty, wyniki niepublikowane) dla katalizowanego przez zasadę wewnątrzcząsteczkowego przeniesienia protonu w 1,3-bis-(4-fluorofenylo)-triazenie rozpuszczonym w eterze etylowo-metylowym. Współczynnik szybkości stanowi średnią dla różnych form wiązań wodorowych reagenta, w szczególności dla wolnej cząsteczki i kompleksu z zasadą. Przenoszenie protonów odbywa się w kompleksie. Wypukła krzywizna Arrheniusa wynika z faktu, że w wysokiej temperaturze cząsteczka przechodzi w formę niekompleksową, gdzie bariera dla przeniesienia protonu jest większa (ref. 55 i H. H. Limbach, komunikacja osobista). Tak więc interpretacja Tolmana nie ma ścisłego zastosowania, ponieważ współczynnik szybkości nie reprezentuje pojedynczego kroku elementarnego. Wykres Arrheniusa reakcji z każdej formy osobno byłby prawdopodobnie quasilinearny lub wklęsły. Jeśli jednak różne formy z wiązaniami wodorowymi są uważane za konformery pojedynczego reagenta, można zastosować interpretację Tolmana, która ilustruje cząsteczkę reagującą wolniej przy wyższej energii, ponieważ eksploruje ona szerszy obszar przestrzeni fazowej, który obejmuje zasadniczo niereaktywne konformery. Podobnie, Massey et al. (23) sugerują możliwe wyjaśnienie ich wypukłego wykresu Arrheniusa obejmującego dwie konkurujące formy enzymatyczne, z których każda dominuje w innym zakresie temperatur. Model ten jest jednym z przykładów modelu, który mógłby być zgodny z przedstawionym tutaj niezależnym od modelu wynikiem. Dla reakcji niebiologicznych spodziewamy się, że szczególnie reaktywne konfiguracje będą często wysokoenergetycznymi gatunkami. Jest możliwe, że wypukłe wykresy Arrheniusa będą bardziej powszechne w systemach biologicznych, ponieważ enzym mógł ewoluować w taki sposób, że stany o najniższej energii (tj. te najbardziej dostępne w temperaturze otoczenia T) są reaktywne, co prowadzi do niskiego E̿ nawet po zwiększeniu T.

Wypukłe wykresy Arrheniusa zostały również zaobserwowane dla dyfuzji w przechłodzonych cieczach i szkłach. Takie przypadki, podobnie jak wspomniany wyżej problem przenikania przez skórę, mogą być skomplikowane z powodu wielu równoległych ścieżek, ale mimo to poddały się szczegółowej analizie. Jednym z powszechnie cytowanych wyjaśnień jest to, że molekuły w cieczach niskotemperaturowych dyfundują przekraczając znaczące bariery potencjału, podczas gdy w wysokiej temperaturze ruchy dyfuzyjne są prawie swobodne (24, 56). Model ten uznaje, że wraz ze wzrostem temperatury, energie termiczne będą większe w porównaniu z wysokością barier; to co jest wymagane dla wypukłego wykresu Arrheniusa to fakt, że średnia energia cząsteczek dokonujących przejść (w tym przypadku, dyfuzyjnych przeskoków z jednego lokalnego minimum do drugiego) rośnie wolniej niż średnia energia wszystkich cząsteczek. Istnieje wiele szczegółowych teorii nie-Arheniusa zachowania w metastabilnych cieczy i szkła, które nie wyraźnie adresować zależność temperatury energii aktywacji w kategoriach interpretacji Tolmana (58), ale każdy spójny wyjaśnienie wypukłej działki Arrheniusa w kategoriach lokalnych równań elementarnych współczynników szybkości musi być zgodne z wynikiem Tolmana na jakimś poziomie bazowym, nawet jeśli to nie jest wyraźne lub nawet nie rozpoznane.

Podsumowując, niniejszy artykuł wskazał na fundamentalną mikrokanoniczną informację, która jest dostarczana przez obserwację wypukłości wykresu Arrheniusa, ale która najwyraźniej nie była wcześniej interpretowana. Analiza ta ma szerokie zastosowanie i pozwala na niezależne od modelu przewidywanie średnich energii układów przechodzących w stan przejściowy. Wynik ten jest istotny dla wszystkich dziedzin kinetyki (w enzymach, w chemii atmosfery, w reakcjach klastrowych, itp.), w których można zaobserwować wypukłe wykresy Arrheniusa, dlatego też utrzymaliśmy prezentację tak ogólną, jak to tylko możliwe, jednocześnie przytaczając ostatnie eksperymenty z termostabilnymi i mezostabilnymi katalizatorami dehydrogenaz i oksydaz jako konkretnymi przykładami wykazującymi to zjawisko. Podkreśliliśmy również związek z teorią dyfuzji. Mamy nadzieję, że punkt widzenia przedstawiony w tej pracy będzie stymulował nowe sposoby myślenia o szybkości reakcji, katalizie i dyfuzji.

• Otrzymano 12 września 2000 r.

.