Discussione
Una varietà di tecniche di blocco cellulare sono in uso da oltre un secolo. L’uso dei blocchi cellulari è stato ampiamente raccomandato nel work-up diagnostico dei pazienti con masse suscettibili di FNA poiché forniscono informazioni diagnostiche architettoniche che completano gli strisci FNA.
In questo studio, lo striscio FNA colorato con Pap era il metodo migliore per le diagnosi di routine grazie alla conservazione superiore delle caratteristiche nucleari e citoplasmatiche mentre la tecnica del blocco cellulare era più adatta alle analisi immunocitochimiche. I nostri risultati suggerirebbero che i campioni di blocco cellulare sono meglio utilizzati come complemento per l’ICC e non per le diagnosi citologiche primarie. La degenerazione delle cellule nei campioni di blocco cellulare può essere attribuita a un ritardo nell’immersione del campione di blocco cellulare nel fissativo subito dopo la raccolta e alla variazione della tecnica FNA tra il personale. Questa variazione nella tecnica può aver contribuito al successo o al fallimento dell’ottenimento di adeguati campioni di blocco cellulare che dipende in gran parte dall’abilità dell’aspiratore e dall’elevata cellularità dell’aspirato.
A causa del ritardo di prefissazione di molti dei campioni di blocco cellulare, è stata osservata una conservazione sub-ottimale della cellularità (23/47), morfologia (41/47) e architettura (28/47) all’inizio dello studio. Di conseguenza, c’era uno scarso accordo e una differenza statisticamente significativa tra i metodi nella valutazione della cellularità (κ – statistica = -0.0022; P 0.0006), della conservazione morfologica (κ – statistica = -0.02; P 0.00) e della conservazione architettonica (κ – statistica = 0.00; P 0.00). Non c’erano campioni FNA (0/47) che hanno ottenuto un punteggio zero per la cellularità, ma l’8,5% (4/47) dei campioni di blocco cellulare erano acellulari. Di questi campioni, il 4% (2/47) è stato ottenuto risciacquando l’ago e il mozzo della siringa e il 4% è stato ottenuto eseguendo un’aspirazione dedicata al campione di blocco cellulare. Una bassa cellularità (punteggio 1) è stata ottenuta per il 40% (19/47) dei campioni di blocco cellulare mentre quella dei campioni FNA era solo l’11% (5/47). Da notare inoltre che più (96%) campioni FNA (45/47) hanno mostrato un punteggio più alto (punteggio 2 e 3) per la cellularità rispetto ai campioni di blocco cellulare, 57% (27/47). Tutti i campioni FNA (47/47) hanno mostrato la conservazione dell’architettura rispetto a solo il 47% (22/47) dei campioni di blocco cellulare. Nella maggior parte dei campioni di blocco cellulare (53%) la conservazione architettonica era assente. Tuttavia, è stato deciso di continuare ad usare il fissativo Formal-Fixx poiché il resto dei campioni (24/47, 6/47 e 19/47 rispettivamente) ha mostrato una conservazione ottimale, illustrata da punteggi di classificazione più alti. Hanley et al. hanno affermato che la conservazione dell’antigenicità delle cellule tumorali è essenziale per analisi immunocitochimiche accurate e l’uso di un fissativo ideale e di parametri ottimali di trattamento dei tessuti è fondamentale a questo proposito. Poiché la conservazione ottimale è stata osservata nel resto dei campioni del blocco di cellule, il fissativo e il programma di trattamento dei tessuti utilizzati sono stati ritenuti adatti. La conservazione sub-ottimale osservata potrebbe essere stata dovuta al tempo di prefissazione.
Nel nostro ambiente, i FNA sono prevalentemente eseguiti da specializzandi in radiologia e patologia la cui esperienza e abilità varia. Di conseguenza, il materiale per il blocco cellulare veniva solitamente aspirato dopo 3 o 4 aspirazioni per lo striscio FNA convenzionale che aveva la priorità. Questo può aver contribuito a un campione più traumatizzato e mal conservato. In molti casi (20/47), non è stato eseguito un passaggio dedicato per i campioni del blocco cellulare. La siringa contenente il campione FNA residuo è stata semplicemente risciacquata nella soluzione fissativa del blocco cellulare. In questi casi, il 65% (13/20) aveva una cellularità subottimale (punteggio 0 e 1). In 30/47 campioni di blocco cellulare, un ago aspirato dedicato è stato posto direttamente nella fiala contenente il fissativo Formal-Fixx di Shandon e il 60% (18/30) ha mostrato una cellularità adeguata (punteggio 2 e 3). Questo dimostra che un ago di aspirazione dedicato per il blocco cellulare migliora la resa.
La deduzione tratta da Bardi e Schwartz indica che la mentalità sia dei pazienti che degli aspiratori è di uguale importanza. Alcuni pazienti non hanno acconsentito a un’ulteriore aspirazione con ago per il campione del blocco cellulare, mentre molti aspiratori erano riluttanti a eseguire ulteriori aspirazioni con ago nonostante il consenso informato dei pazienti. Ciò era dovuto al fatto che il paziente non era in grado di sopportare la procedura, al rischio di causare un pneumotorace nei pazienti sottoposti a FNA polmonare, alla mancanza di suscettibilità della massa all’FNA, ai limiti di tempo, all’inesperienza o semplicemente al fatto di non essere disposti a farlo. Sebbene non sia statisticamente evidente, i campioni raccolti per la tecnica del blocco cellulare potrebbero essere stati svantaggiati dal fatto di non ricevere un’aspirazione dedicata. Tutto ciò potrebbe aver contribuito alla scarsa conservazione cellulare, morfologica e architettonica dei blocchi cellulari e allo scarso accordo tra i due metodi di preparazione dei campioni.
C’è stato uno scarso accordo nell’immunostain CK7 che è stato l’unico test a mostrare una differenza statisticamente significativa (P 0,02) tra i metodi. La CK7 è stata eseguita su 44 campioni. Di questi, il 34% (15/44) era negativo nel campione del blocco cellulare e il 13,6% (6/44) nei campioni FNA. Nella valutazione del background (BG) / colorazione aspecifica nelle immunostains, una differenza statisticamente significativa in questa discordanza è stata ottenuta per CK 7 (K 0,03; P-value 0,0001), CK20 (K 0,01; P-value 0,00), TTF1 (K 0,00; P-value 0,03) e immunostains sinaptofisina (K 0,15; P-value 0,03). In tutti i casi, un numero maggiore di campioni di blocco cellulare non ha mostrato alcuna colorazione di fondo (punteggio 0) rispetto ai campioni FNA. La colorazione aberrante non specifica non è stata osservata nei corrispondenti controlli negativi del blocco cellulare e nelle immunostains accoppiate AE 1/3. Una possibile spiegazione di questo fenomeno è che non tutti gli antigeni sono suscettibili di degradazione o diffusione anossica, così come non tutti gli antigeni sono ugualmente interessati dalla fissazione. I campioni di FNA più colpiti dalla colorazione di fondo e anomala erano alcuni campioni di FNA del fegato, campioni contenenti detriti proteici e campioni prevalentemente necrotici o molto spessi che indicavano che il problema era intrinseco. Kung et al. hanno fatto un’osservazione simile per quanto riguarda l’intensità di colorazione più forte, la mancanza di colorazione aspecifica e la mancanza di colorazione aberrante nei campioni di blocco cellulare, specialmente con le macchie di citocheratina.
Sono stati ottenuti risultati discordanti per un campione – un FNA del fegato. L’immunocitochimica eseguita su questo striscio ha dimostrato la positività delle cellule tumorali per CK7 e sinaptofisina, mentre CK20 era negativa. Questo profilo citocheratinico si osserva nel 56% dei carcinomi neuroendocrini del polmone. Lo stesso pannello di test eseguito sul campione di blocco cellulare corrispondente era negativo. Anche se tutti e 3 i test sono stati ripetuti, i risultati sono rimasti invariati. Una possibile spiegazione potrebbe essere la conservazione sub-ottimale dell’antigenicità delle cellule tumorali in questo campione che è stato in qualche modo reso più suscettibile di altri.
La ricerca futura in questo dipartimento trarrebbe beneficio dall’esplorazione dell’uso della formalina neutra tamponata al 10% (NBF) come fissativo di scelta nella preparazione di campioni di blocco cellulare per l’immunoistochimica (IHC) con una diminuzione del tempo tra la raccolta del campione e la fissazione. Un comitato ad hoc per la standardizzazione dell’immunoistochimica, affiliato al College of American Pathologists, ha scoraggiato l’uso di fissativi non basati sulla formalina e di metodologie di fissazione alternative. Questo è dovuto al fatto che i dati di performance del test IHC usando altri fissativi sono limitati e l’estrapolazione dai dati esistenti è inaffidabile. Axe et al. hanno prodotto blocchi di cellule da FNA del fegato che sono stati fissati in NBF al 10% con una conservazione ottimale della cellularità e un IHC di successo permettendo così la sottoclassificazione del tumore.
Con l’uso del sistema di preparazione dei blocchi di cellule Shandon Cytoblock è stato possibile catturare piccoli gruppi di cellule. Una tecnica migliorata di preparazione del blocco cellulare e di cattura delle cellule è stata ideata da Varsegi e Shidham che può essere utile incorporare nel metodo attuale. Utilizzando la tecnica di Varsegi aumenta la possibilità di catturare cellule sparse individualmente con l’uso di Histogel (Thermo Shandon), evitando così che l’istotecnologo tagli troppo profondamente il blocco e rischi di perdere l’area con le cellule di interesse. Sebbene non sia statisticamente evidente, i campioni raccolti per la tecnica del blocco cellulare potrebbero essere stati svantaggiati dal fatto di non aver ricevuto un’aspirazione iniziale dedicata che potrebbe aver compromesso la cellularità. A questo proposito, l’ottenimento di materiale da più aspirazioni dell’ago dedicate per il blocco cellulare dovrebbe essere esplorato per migliorare la resa.
Il ruolo della preparazione del blocco cellulare nella citopatologia diagnostica è senza dubbio di immensa importanza in quanto consente molteplici indagini speciali e di conseguenza una diagnosi citologica più raffinata. La metodologia potrebbe essere migliorata modificando le tecniche e riducendo le limitazioni poste in questo studio, vale a dire esplorando l’uso della formalina neutra tamponata al 10% (NBF) come fissativo di scelta nella preparazione di campioni di blocco cellulare per l’immunoistochimica (IHC), con una diminuzione del tempo tra la raccolta del campione e la fissazione e la standardizzazione della tecnica FNA tra il personale. Gli strisci FNA diretti e i blocchi di cellule si completano a vicenda e i nostri risultati indicano che entrambi sono necessari nel work-up diagnostico dei pazienti; il primo per valutare la morfologia, e il secondo per risultati ottimali di immunocitochimica. In ambienti con risorse limitate, le implicazioni di costo dell’esecuzione di strisci convenzionali e bloccati su tutto il materiale FNA richiedono ulteriori valutazioni.