4.3. Struttura del recettore nicotinico
Il recettore nicotinico dell’organo elettrico e del muscolo scheletrico dei vertebrati è un pentamero composto da quattro subunità distinte (a, b, g e d) nel rapporto stechiometrico di 2:1:1:1, rispettivamente. Nelle terminazioni muscolari mature e innervate, la subunità g è sostituita dalla e, una subunità strettamente correlata. Le singole subunità sono circa il 40% identiche nelle loro sequenze di aminoacidi, derivanti da un gene primordiale comune. Il recettore nicotinico divenne il prototipo di altri canali ionici pentamerici ligando-gated, che includevano i recettori per gli aminoacidi inibitori (acido g-aminobutirrico e glicina) e alcuni recettori della serotonina (5-HT3). Ciascuna delle subunità del recettore pentamerico ha una massa molecolare da 40 000 a 60 000 dalton. I 210 residui amino-terminali costituiscono praticamente tutto il dominio extracellulare. Questo è seguito da quattro domini transmembrana-spanning (TM); la regione tra il terzo e il quarto dominio forma la maggior parte della componente citoplasmatica. Ciascuna delle subunità del recettore nicotinico dell’ACh ha un’esposizione extracellulare e una intracellulare sulla membrana postsinaptica. Le cinque subunità sono disposte intorno a uno pseudo-asse di simmetria per circoscrivere un canale situato internamente.
Il recettore è una molecola asimmetrica (14 nm×8 nm) di 250 000 dalton, con la maggior parte del dominio non membrana-spanning sulla superficie extracellulare. Nelle aree di giunzione (cioè la piastra terminale del motore nel muscolo scheletrico e la superficie ventrale dell’organo elettrico), il recettore è presente ad alte densità (10 000/mm2) in un ordine di impacchettamento regolare. Questo ordinamento dei recettori ha permesso la ricostruzione al microscopio elettronico della sua struttura molecolare. Una proteina legante l’ACh omologa solo al dominio extracellulare del recettore nicotinico è stata identificata nelle lumache d’acqua dolce e salata e caratterizzata strutturalmente e farmacologicamente.
Questa proteina si assembla come un pentamero omomerico e lega i ligandi del recettore nicotinico con la selettività attesa; la sua struttura cristallina rivela un’organizzazione atomica attesa del recettore nicotinico. Inoltre, la fusione della proteina legante l’ACh e le spanne transmembrana del recettore producono una proteina funzionale che esibisce il gating del canale e i cambiamenti di stato previsti per il recettore. Questa proteina legante serve come un surrogato strutturale e funzionale del recettore e ha fornito una comprensione dettagliata dei determinanti che governano la specificità del ligando del recettore nicotinico. I siti di legame degli agonisti si trovano alle interfacce delle subunità, ma nel muscolo, solo due delle cinque interfacce delle subunità, a g e a d, si sono evolute per legare i ligandi. Il legame degli agonisti, degli antagonisti competitivi reversibili e della tossina elapide a è reciprocamente esclusivo e coinvolge superfici sovrapposte sul recettore. Entrambe le subunità che formano l’interfaccia della subunità contribuiscono alla specificità del ligando. Le misure delle conduttanze di membrana dimostrano che i tassi di traslocazione degli ioni sono sufficientemente rapidi (5×107 ioni al secondo) da richiedere la traslocazione degli ioni attraverso un canale aperto piuttosto che da un vettore rotante di ioni. Inoltre, i cambiamenti mediati dall’agonista nella permeabilità ionica (tipicamente un movimento verso l’interno di Na+ e secondariamente di Ca2+) avvengono attraverso un canale cationico intrinseco alla struttura del recettore. La seconda regione transmembrana su ciascuna delle cinque subunità forma il perimetro interno del canale. Il sito di legame dell’agonista è intimamente accoppiato con un canale ionico; nel recettore muscolare, il legame simultaneo di due molecole agoniste provoca un rapido cambiamento conformazionale che apre il canale. Sia il legame che la risposta di gating mostrano una cooperatività positiva. I dettagli sulla cinetica di apertura del canale si sono evoluti dalle tecniche elettrofisiologiche di patch-clamp che distinguono i singoli eventi di apertura e chiusura di una singola molecola del recettore e confermano che i recettori nicotinici dell’acetilcolina (nAChR) sono canali ionici pentamerici ligandgated che è composto da subunità che consistono di un dominio extracellulare che porta il sito di legame del ligando e un dominio distinto di ione-poro. La trasduzione del segnale risulta dall’accoppiamento allosterico tra i due domini che sono distanza dal sito di legame al cancello del dominio poro è 50 Å. Tuttavia, gli studi di legame del recettore sono specifici per i recettori colinergici nicotinici che sono stati effettuati su epiteli vestibolari isolati delle rane Rana catesbiana e Rana temporaria. Viene presentata la prova della presenza di recettori colinergici nicotinici associati specificamente alle aree sensoriali, e studiato il legame di conformazioni atipiche di agonisti nicotinici che conferiscono selettività al sottotipo e si conclude che il nAChR ha un ruolo cruciale nella neurotrasmissione eccitatoria e gioca un obiettivo importante per farmaci e insetticidi. Diversi sottotipi di nAChR con varie combinazioni di subunità che conferiscono selettività differenziale per i farmaci nicotinici, e ha anche identificato la famiglia di geni che codificano per proteine omologhe alla subunità α del recettore nicotinico muscolare dell’acetilcolina nel genoma del ratto. Questi geni sono trascritti nel sistema nervoso centrale e periferico in aree che sono note per contenere recettori nicotinici funzionali. Il ruolo giocato dai recettori nicotinici neuronali contenenti β2 (nAChRs) nel mediare gli effetti collaterali della nicotina nel feto e nel neonato. Topi incinta WT e mutanti privi della subunità β2 nAChR sono stati impiantati con minipompe osmotiche che erogavano acqua o una dose controllata di nicotina. Successivamente, c’è stato un confronto dello sviluppo del sistema simpatico-adrenale e dei riflessi di respirazione e di eccitazione della prole poco dopo la nascita, un periodo di maggiore vulnerabilità all’esposizione alla nicotina. D’altra parte, i neonicotinoidi, come l’imidacloprid, sono agonisti nAChR con una potente attività insetticida. Dalla sua introduzione nei primi anni ’90, l’imidacloprid è diventato uno degli insetticidi più ampiamente utilizzati sia per la protezione delle colture che per applicazioni di salute animale, la base molecolare della resistenza all’imidacloprid, cinque subunità nAChR (Nlα1-Nlα4 e Nlβ1) sono stati clonati da Nilaparvata lugens. Un confronto tra i geni delle subunità nAChR delle popolazioni sensibili e resistenti all’imidacloprid ha identificato una singola mutazione puntiforme in una posizione conservata (Y151S) in due subunità nAChR, Nlα1 e Nlα3. Una forte correlazione tra la frequenza della mutazione puntiforme Y151S e il livello di resistenza all’imidacloprid è stata dimostrata dalla PCR allele-specifica. Con l’espressione di nAChR ibridi contenenti le subunità α di Nilaparvata lugens e β2 di ratto, sono state ottenute prove che dimostrano che la mutazione Y151S è responsabile di una sostanziale riduzione del legame specifico di imidacloprid. Questo studio fornisce la prova diretta del verificarsi di una resistenza target-site a un insetticida neonicotinoide, e ha indagato sulla natura del sito di legame cationico-π nel recettore nicotinico e trova che il recettore nicotinico dell’acetilcolina è il prototipo di canale ionico ligando-gated. Un certo numero di amminoacidi aromatici sono stati identificati come contribuenti al sito di legame dell’agonista, suggerendo che le interazioni catione-π possono essere coinvolte nel legame del gruppo di ammonio quaternario dell’agonista, l’acetilcolina. La conformazione delle molecole colinergiche ai recettori nervosi nicotinici, e trova una correlazione delle analisi delle strutture di cristallo dei potenti agonisti nicotinici acetilcolina, acetil-α-metilcolina, lattoilcolina, 1,1-dimetil-4-fenilpiperazina, e nicotina permette di determinare la conformazione degli agonisti colinergici pertinenti ai recettori nervosi nicotinici. L’espressione dei recettori dei neurotrasmettitori codificati dagli mRNA isolati da tre linee cellulari di glioma umano. Gli ovociti iniettati con mRNA di due linee cellulari di glioblastoma non hanno mostrato risposte elettriche ai vari neurotrasmettitori testati.
Modulazione del nAChR da parte della stricnina trova che la stricnina è un antagonista potente e selettivo ai recettori della glicina che è stato trovato per inibire il muscolo (α 1β 1γ δ, α 1β 1γ, e α 1β 1δ) e neuronale (α 2β 2 e α 2β 4) recettori nicotinici dell’acetilcolina (AcChoRs) espressi in ovociti Xenopus. La stricnina da sola (fino a 500 µmol/L) non ha suscitato correnti di membrana in oociti che esprimono AcChoRs, ma quando è stata applicata prima, in concomitanza o durante la superfusione di acetilcolina (AcCho), ha inibito rapidamente e reversibilmente la corrente suscitata da AcCho (AcCho-corrente). La traduzione di RNA messaggero esogeno che codifica per nAChRs produce recettori funzionali in ovociti di Xenopus, in questo studio RNA messaggero estratto dall’organo elettrico di Torpedo è stato iniettato in ovociti di Xenopus. Questo ha portato alla sintesi e all’incorporazione di recettori funzionali dell’acetilcolina nella membrana dell’ovocita. Quando attivati dall’acetilcolina, questi recettori dell’acetilcolina di Torpedo nella membrana dell’ovocita aprivano canali la cui permeabilità ionica assomigliava a quella dei recettori nicotinici in altre cellule.
La localizzazione dei recettori dell’acetilcolina (AChR) nella superficie delle cellule miogeniche in via di sviluppo dei muscoli latissimus dorsi anteriori e posteriori dell’embrione di pulcino in relazione al processo di innervazione è stato studiato a livello ultrastrutturale utilizzando un coniugato di perossidasi di rafano-α-bungarotossina. Concentrazioni localizzate di AChR sono state trovate in piccole regioni 0.1-0.4 µm di larghezza sulla superficie delle cellule miogeniche di muscoli da 10 a 14 giorni, e sono stati studiati anche gli effetti dell’acetilcolina e degli agenti che imitano o bloccano le sue azioni fisiologiche sulle concentrazioni di guanosina 3′:5′-monofosfato ciclico (GMP ciclico) e adenosina 3′:5′-monofosfato ciclico (AMP ciclico) in fette di corteccia cerebrale di mammifero, ventricolo cardiaco e ileo. L’acetilcolina e gli agenti colinomimetici ad azione prevalentemente muscarinica, come la metacolina, il betanecolo e la pilocarpina, hanno indotto un aumento della concentrazione di GMP ciclico o una leggera diminuzione della concentrazione di AMP ciclico in tutti e tre i tessuti studiati.
Le proprietà funzionali e la localizzazione cellulare del recettore neuronale umano α7 AcCho (α7 AcChoR) e la sua forma mutata L248T (mut) sono state studiate esprimendole da sole o come fusioni geniche con la versione potenziata della proteina fluorescente verde (GFP). Gli ovociti di Xenopus iniettati con i cDNA delle subunità wild-type, mutα7 o chimeriche hanno espresso recettori che hanno attivato correnti di membrana quando esposti ad AcCho. Come già noto, le correnti di AcCho generate dai recettori wtα7 decadono molto più velocemente di quelle generate dai recettori mutα7. Interazione dei recettori nicotinici β2 e le vie della dopamina nel controllo della locomozione spontanea, e trova l’acetilcolina (ACh) è un noto modulatore dell’attività dei neuroni dopaminergici (DAergic) attraverso la stimolazione dei nAChRs. Tuttavia, la composizione delle subunità e la posizione specifica dei nAChR coinvolti nella locomozione DA-mediata rimangono da stabilire in vivo. I topi privi della subunità β2 dei nAChR (β2KO) mostrano un’impressionante iperattività in campo aperto, il che suggerisce uno squilibrio nella neurotrasmissione DA. Tuttavia, la mutazione all’interno del dominio M2 del recettore nicotinico converte la 5-idrossitriptamina da antagonista ad agonista, lo studio è stato fatto sugli effetti della 5-idrossitriptamina (5HT) sui recettori nicotinici omomerici neuronali (nAcChoR) espressi in ovociti di Xenopus dopo l’iniezione di cDNA che codifica la subunità di pollo wild-type. AcCho ha suscitato grandi correnti che sono state ridotte da 5HT in modo reversibile e dose-dipendente, con una concentrazione semi-inibitoria e un coefficiente di Hill. Anche se lo studio del recettore colinergico dei linfociti T citotossici e gli agonisti colinergici hanno la capacità dei linfociti sensibilizzati di ferire le cellule che portano gli alloantigeni sensibilizzanti, il recettore colinergico della popolazione di linfociti attaccanti è stato studiato con la manipolazione farmacologica di un sistema in vitro che quantifica la lesione mediata dalle cellule attaccanti sensibilizzate sulle cellule bersaglio.