Vistatori statunitensi e canadesi, richiedete un campione gratuito del nostro kit di estrazione del DNA vegetale SYNERGY™ 2.0 basato su CTAB QUI.
L’isolamento del DNA dai tessuti vegetali può essere molto difficile in quanto la biochimica tra specie vegetali divergenti può essere estrema. A differenza dei tessuti animali, dove lo stesso tipo di tessuto di specie diverse di solito ha caratteristiche simili, le piante possono avere livelli variabili di metaboliti e biomolecole strutturali. I polisaccaridi e i polifenoli sono due classi di biomolecole vegetali che variano ampiamente tra le specie e sono molto problematiche quando si isola il DNA. Polisaccaridi e polifenoli contaminanti possono interferire con le manipolazioni del DNA dopo l’isolamento.
Sono disponibili metodi che rimuovono efficacemente polisaccaridi e polifenoli dalle preparazioni di DNA vegetale. L’uso del CTAB (cetil trimetilammonio bromuro), un detergente cationico, facilita la separazione dei polisaccaridi durante la purificazione, mentre gli additivi, come il polivinilpirrolidone, possono aiutare a rimuovere i polifenoli. I tamponi di estrazione a base di CTAB sono ampiamente utilizzati quando si purifica il DNA dai tessuti vegetali.
Un’opzione per purificare il DNA usando il CTAB sfrutta il fatto che i polisaccaridi e il DNA hanno diverse solubilità nel CTAB a seconda della concentrazione di cloruro di sodio. A concentrazioni di sale più alte, i polisaccaridi sono insolubili, mentre a concentrazioni più basse il DNA è insolubile. Di conseguenza, regolando la concentrazione di sale nei lisati contenenti CTAB, i polisaccaridi e il DNA possono essere precipitati in modo diverso.
I polifenoli sono composti che contengono più di un anello fenolico (ad esempio, il tannino), una struttura che si lega in modo molto efficiente al DNA. Sono naturalmente presenti nelle piante, ma vengono anche generati quando le piante subiscono danni ai tessuti (imbrunimento). Dopo l’omogeneizzazione dei tessuti vegetali, i polifenoli vengono sintetizzati dalla polifenolo ossidasi liberata. L’aggiunta di pirrolidone polivinilico impedisce l’interazione tra il DNA e gli anelli fenolici legando i polifenoli.
I protocolli basati su CTAB tendono a funzionare molto bene, ma uno svantaggio significativo è che le estrazioni di cloroformio sono usate abitualmente per separare le molecole organiche solubili dal DNA. Poiché il cloroformio è cancerogeno, molte istituzioni disapprovano il suo uso. Pertanto, un metodo alternativo che evita il cloroformio è stato sviluppato da OPS Diagnostics; può essere trovato alla pagina Synergy™ Plant DNA Extraction Kit.
Materiali
- Tampone CTAB: 2% cetil trimetilammonio bromuro, 1% polivinilpirrolidone, 100 mM Tris-HCl, 1. 4 M NaCl, 20 mM M.4 M NaCl, 20 mM EDTA, o CTAB Extraction Buffer
- Centrifuga (fino a 14.000 x g)
- Soluzione RNase A
- Isopropanolo
- 70% Etanolo
- 2 ml tubi da centrifuga
- SpeedVac
- TE Buffer (10 mM Tris, pH 8, 1 mM EDTA)
Metodo
I campioni di piante possono essere preparati macinando criogenicamente i tessuti in un mortaio e pestello dopo il raffreddamento in azoto liquido. Le piante liofilizzate possono essere macinate a temperatura ambiente. In entrambi i casi, una polvere fine è la migliore per l’estrazione del DNA.
- Per ogni 100 mg di tessuto omogeneizzato usare 500 µl di CTAB Extraction Buffer. Mescolare e vortexare accuratamente. Trasferire l’omogeneizzato in un bagno a 60°C per 30 minuti.
- Dopo il periodo di incubazione, centrifugare l’omogeneizzato per 5 minuti a 14.000 x g.
- Trasferire il surnatante in una nuova provetta. Aggiungere 5 µl di soluzione A di RNasi e incubare a 37°C per 20 minuti
- Aggiungere un volume uguale di cloroformio/alcool isoamilico (24:1). Vortexare per 5 secondi poi centrifugare il campione per 1 minuto a 14.000 x g per separare le fasi. Trasferire la fase superiore acquosa in una nuova provetta. Ripetere questa estrazione fino a quando la fase superiore è chiara.
- Trasferire la fase acquosa superiore in una nuova provetta. Precipitare il DNA aggiungendo 0,7 volumi di isopropanolo freddo e incubare a -20°C per 15 minuti.
- Centrifugare il campione a 14.000 x g per 10 minuti. Decantare il surnatante senza disturbare il pellet e successivamente lavare con 500 µl di etanolo al 70% freddo. Decantare l’etanolo. Rimuovere l’etanolo residuo asciugando in uno SpeedVac.
- Asciugare il pellet abbastanza a lungo da rimuovere l’alcol, ma senza asciugare completamente il DNA. Sciogliere il DNA in 20 µl di tampone TE (10 mM Tris, pH 8, 1 mM EDTA). Il pellet potrebbe aver bisogno di essere riscaldato per dissolversi.
Protocollo opzionale:
L’uso di colonne di spin in silice può produrre DNA di qualità superiore. Per un protocollo opzionale, clicca qui.