Activarea integrinei CD11b determină imunitatea înnăscută anti-tumorală

Integrina CD11b reglează polarizarea macrofagelor

Am raportat anterior că receptorul VCAM integrina α4β1 promovează recrutarea celulelor mieloide din măduva osoasă în micro-mediul tumoral, stimulând astfel suprimarea imunitară, angiogeneza și progresia tumorală2,13,14,15. Spre deosebire de rolul său în reglarea recrutării celulelor mieloide în țesuturi în timpul inflamației acute16,17,18, am constatat că CD11b (αMβ2), un receptor al integrinei celulelor mieloide pentru ICAM-1 și fibrinogen, nu afectează recrutarea celulelor mieloide în tumori, deoarece deleția globală a CD11b la șoarecii Itgam-/- nu are niciun efect asupra numărului de celule mieloide în circulație sau asupra numărului de celule recrutate în tumori (Figura suplimentară 1; Figura suplimentară 2a-d). Cu toate acestea, în mod surprinzător, am constatat că integrina CD11b joacă un rol esențial în reglarea polarizării macrofagelor. Macrofagele Itgam-/-/- au prezentat o expresie sporită a genelor și proteinelor imunosupresoare și o expresie puternic redusă a genelor și proteinelor proinflamatorii în comparație cu macrofagele WT, indiferent dacă au fost stimulate în condiții bazale, în condiții de stimulare cu IL-4 sau IFNγ/LPS (Fig. 1a, Figura suplimentară 2e-f). Pentru a determina dacă CD11b reglează, de asemenea, polarizarea macrofagelor in vivo, am izolat și caracterizat F4/80 + TAMs din tumorile LLC cultivate la șoareci Itgam-/- și WT. Am constatat că TAM-urile Itgam-/-/- au exprimat, de asemenea, niveluri semnificativ mai ridicate de ARNm asociate cu supresia imunitară și angiogeneza, cum ar fi Arg1, Tgfb, Il10, Il6 și Pdgfb, și o expresie semnificativ mai scăzută a genelor asociate cu stimularea imunitară, cum ar fi Ifng, Nos2 și Tnfa decât TAM-urile WT (Fig. 1b, Figura suplimentară 2g).

Important este faptul că reducerea tranzitorie a CD11b mediată de siRNA în macrofagele cultivate in vitro a ridicat expresia genelor imunosupresoare și a scăzut expresia genelor imunostimulatoare, efecte comparabile cu ștergerea CD11b (Fig. 1c), indicând că până și pierderea tranzitorie a CD11b controlează expresia genelor imunosupresoare ale macrofagelor. Pentru a stabili dacă expresia sau funcția CD11b controlează expresia genică a macrofagelor, am examinat efectul anticorpilor CD11b inhibitori asupra expresiei ARNm a macrofagelor. Blocarea atașamentului mediat de CD11b al macrofagelor murine la substraturile acoperite cu ICAM-1 cu ajutorul anticorpilor neutralizanți anti-CD11b a indus, de asemenea, expresia ARNm imunosupresor în macrofage (Fig. 1d). În mod similar, aderența macrofagelor la substratul VCAM-1 al integrinei α4β1 sau pierderea atașamentului prin cultură în suspensie a promovat transcrierea imunosupresoare murină și umană, în timp ce atașarea la suprafețele acoperite cu ICAM-1 a promovat transcrierea imunostimulatoare (Fig. 1e, f, figura suplimentară 1h), ceea ce indică faptul că ligatura CD11b controlează transcripția macrofagică imunostimulatoare.

Pierderea exprimării citokinelor proinflamatorii în macrofagele Itgam-/-/- a sugerat că CD11b poate regla activarea factorilor de transcripție proinflamatori, cum ar fi NFκB. Am constatat că macrofagele Itgam-/- au prezentat o fosforilare redusă a serinei 536 a NFκB (o indicație a unei activări reduse19) ca răspuns la stimularea cu LPS în comparație cu macrofagele WT, sugerând că CD11b joacă un rol în activarea NFκB (Fig. 1g). Deoarece alte studii au implicat CD11b în promovarea răspunsurilor proinflamatorii ale monocitelor și celulelor dendritice prin interacțiuni directe ale LPS cu domeniile extracelulare ale integrinei beta220,21, rezultatele noastre indică faptul că activarea și semnalizarea CD11b joacă roluri-cheie în reglarea polarizării macrofagelor in vitro și in vivo.

Macrofagele CD11b reglează creșterea tumorală

Datele noastre indică faptul că macrofagele derivate din măduva osoasă Itgam-/- și cele asociate tumorilor prezintă mai multe profiluri transcripționale imunosupresoare decât macrofagele WT. Pentru a determina dacă această diferență afectează creșterea tumorală, am transferat prin adopție macrofage derivate din măduva osoasă WT sau Itgam-/-/- sau macrofage asociate cu tumori cu celule tumorale în șoareci primitori WT sau Itgam-/–. Anterior, am demonstrat că BMDM sau TAM transferate adoptiv, imunosupresoare, pot stimula creșterea tumorală9,10. În mod remarcabil, macrofagele derivate din măduva osoasă Itgam-/-/- (Fig. 1h), precum și macrofagele derivate din tumori Itgam-/-/- (Fig. 1i) au stimulat puternic creșterea tumorală în comparație cu macrofagele WT atât la șoarecii WT, cât și la cei Itgam-/-. Deoarece macrofagele Itgam-/- prezintă un profil transcripțional imunosupresor (Fig. 1b), iar tumorile derivate de la șoarecii Itgam-/- prezintă un profil transcripțional imunosupresor general (Fig. 1j), aceste date au sugerat că expresia sau activarea CD11b ar putea avea un impact asupra creșterii globale a tumorii. Într-adevăr, am constatat că tumorile subcutanate (LLC), ortotopice (melanom) și autohtonă (PyMT) au crescut mai agresiv la șoarecii Itgam-/- decât la șoarecii WT (Fig. 1k). Deoarece șoarecii Itgam-/-/- au prezentat substanțial mai multe CD4 + Foxp3 + Tregs și mai puține celule T CD8+ în tumori decât șoarecii WT (Figura suplimentară 3a-b), studiile noastre susțin concluzia că CD11b joacă un rol cheie în reglarea răspunsului imunitar general în tumori.

Studii anterioare au arătat că Isoleucina 332 din molecula CD11b servește ca un comutator alosteric care controlează activarea și forma receptorului de adeziune22. Pentru a determina dacă activarea CD11b controlează dezvoltarea tumorilor, am generat o tulpină de șoareci CD11b knockin activată constitutiv (C57BL/6 ITGAMI332G prin introducerea unei mutații punctiforme I332G în gena murină Itgam. Șoarecii knockin I332G exprimă niveluri normale de CD11b de suprafață celulară atât pe monocite, cât și pe granulocite și prezintă niveluri normale la nivelul tuturor celulelor sanguine (Figura suplimentară 3c-d). Testele de adeziune in vitro cu macrofage derivate din măduva osoasă de la acești șoareci au arătat că celulele I332G exprimă CD11b constitutiv activ (figura suplimentară 3e). În mod important, șoarecii I332G Itgam knockin au prezentat o creștere tumorală LLC semnificativ redusă (Fig. 1k). Astfel, în timp ce ștergerea CD11b stimulează polarizarea macrofagelor antiinflamatoare, inhibă recrutarea celulelor T CD8+ și promovează creșterea tumorală, activarea CD11b inhibă puternic creșterea tumorală. Aceste studii indică faptul că CD11b macrofagian joacă un rol funcțional critic în controlul creșterii tumorale.

Semnele imunosupresoare inhibă expresia CD11b

Pentru a determina dacă semnalele asociate cu micro-mediul tumoral pot modifica expresia CD11b și, ulterior, pot afecta polarizarea celulelor mieloide, am evaluat efectul mediilor macrofagice (mCSF-, IL-4- și IFNγ/LPS) asupra expresiei CD11b de la suprafața celulară în macrofagele derivate din măduva osoasă. În timp ce citokina imunosupresoare IL-4 a redus expresia CD11b, stimulii proinflamatori IFNγ/LPS au sporit expresia CD11b de suprafață în comparație cu nivelurile exprimate pe macrofagele stimulate cu mCSF (Figura suplimentară 4a-b). În plus, factorul imunosupresor TGFβ, dar nu și IL-10, a inhibat expresia de suprafață a CD11b (figura suplimentară 4c); TGFβ, IL-4 și mediul condiționat de celule tumorale (TCM) au suprimat fiecare, de asemenea, expresia ARNm Cd11b (figura suplimentară 4d). Este important de remarcat faptul că TGFβ și TCM au redus expresia suprafeței celulare CD11b și au stimulat transcripția imunosupresoare, inhibând în același timp transcripția imunostimulatoare într-un mod care a fost inversat de inhibitorul TGFβR1 SB525334 (Figura suplimentară 4e-g). Aceste date indică faptul că citokinele, cum ar fi TGFβ din micro-mediul tumoral, suprimă expresia sau activarea CD11b, promovând astfel polarizarea macrofagelor imunosupresoare.

Codul macrofagic CD11b reglează stabilitatea vaselor de sânge

Macrofagele nu controlează doar răspunsurile imune, ci și angiogeneza și desmoplazia, prin exprimarea unor citokine precum VEGF-A și PDGF-BB, factori de creștere care reglează celulele endoteliale și mușchii netezi vasculari/pericitele în timpul angiogenezei, respectiv2. Vasele sanguine tumorale constau adesea dintr-un singur strat endotelial căruia îi lipsesc pericitele sau celulele musculare netede de susținere; aceste vase sanguine sunt mai numeroase în tumori decât în țesuturile normale, dar sunt formate în mod aberant și sunt slab perfuzate. În schimb, în tumorile cu un raport ridicat între PDGF și VEGF, vasele de sânge sunt căptușite cu pericite, celule mezenchimale care stabilizează vasele și favorizează o mai bună perfuzie tumorală23,24,24,25,25,26,27. Aceste tumori cresc mai rapid decât tumorile cu un raport PDGF/VEGF mai mic, dar răspund, de asemenea, mai bine la chimioterapie și imunoterapie datorită unei mai bune perfuzii tumorale24,25,26,27,27,28,29,29,30,31,31,32,33,33,34,34,35,36. Deoarece macrofagele Itgam-/-/- au prezentat o expresie genetică PDGF ridicată și VEGF scăzută (Fig. 1a, b), am examinat modelele de dezvoltare a vaselor de sânge în tumorile Itgam-/-/- și WT. O evaluare a configurației vasculare în tumorile LLC și PyMT de la șoareci WT și Itgam-/- a arătat că tumorile Itgam-/- prezintă mai puține vase de sânge, mai lungi, cu lumenuri mai largi și mai puține puncte de ramificare/câmp decât tumorile WT (Fig. 2a, b; Figura suplimentară 5a). Tumorile Itgam-/-/- aveau mai multe vase de sânge care erau căptușite cu pericite/celule musculare netede Desmin+, NG2+ sau SMA+ decât tumorile WT (Fig. 2a-c; Figura suplimentară 5b). În consecință, aceste vase au fost mai puțin permeabile la șoarecii Itgam-/- decât la șoarecii WT, deoarece mai puțin FITC-dextran intravascular s-a scurs în parenchimul tumoral (Fig. 2a-d). Aceste date indică faptul că integrina CD11b joacă un rol în controlul maturării vaselor de sânge. Am constatat că expresia genetică a PDGF-BB, dar nu și a VEGF-A, a fost puternic crescută în tumori (Fig. 2e; Figura suplimentară 5c). În mod important, expresia proteinei PDGF-BB a fost, de asemenea, crescută în tumorile Itgam-/-/- și în macrofagele derivate din tumori în comparație cu tumorile WT (Fig. 2f). Împreună, aceste date sugerează că macrofagele CD11b controlează vascularizația tumorală prin expresia constitutivă a unor niveluri ridicate de PDGF.

În sprijinul acestor observații privind rolurile CD11b în neovascularizație, am constatat că șoarecii Itgam-/- au prezentat un plex vascular retinian bine dezvoltat (Fig. 2g, Isolectin B+, verde) la naștere (P1) în comparație cu șoarecii WT, care prezintă o vascularizație retiniană nedezvoltată care se extinde progresiv din ziua postnatală 1 (P1 până la P9). Plexul vascular superficial a fost mai dezvoltat la șoarecii Itgam-/- din ziua postnatală P1 până în ziua postnatală P9 decât la nou-născuții WT (Fig. 2g). Aceste rezultate indică faptul că macrofagele și CD11b joacă roluri cheie în controlul modelării vasculare normale.

Pentru a investiga dacă PDGF-BB ridicat este responsabil pentru maturarea vasculară îmbunătățită și creșterea tumorală la șoarecii Itgam-/-, am tratat șoarecii WT și Itgam-/- care poartă tumori LLC cu imatinib, un inhibitor al receptorului PDGF-BB PDGFR1. Tratamentul cu imatinib a suprimat creșterea sporită a tumorii observată la șoarecii Itgam-/- (Fig. 2h, i). De asemenea, a crescut densitatea vasculară și a suprimat normalizarea vasculară la șoarecii Itgam-/- (Fig. 2h, i). Împreună, aceste rezultate susțin conceptul că integrina CD11b modulează dezvoltarea vasculară prin controlul expresiei PDGF-BB.

CD11b reglează expresia Let7a și c-Myc

CD11b poate controla polarizarea macrofagelor antiinflamatorii prin activarea factorilor de transcripție, cum ar fi Stat3, care poate promova expresia factorilor imunosupresori și pro-angiogenici, cum ar fi Arginase 1, Myc și VEGF37,38,39. Macrofagele Itgam-/- prezintă Stat3 fosforilat în mod constitutiv (Fig. 3a inset); nivelurile ridicate de expresie a factorilor imunosupresori în macrofagele Itgam-/- au fost reduse la nivelurile macrofagelor WT prin tratament cu inhibitorul Stat3 5,15-DPP (Fig. 3a). Cu toate acestea, în mod surprinzător, inhibarea Stat3 nu a afectat nivelurile ridicate de expresie a Il6 observate în macrofagele Itgam-/-/ (Fig. 3a). Este important faptul că IL-6 poate activa direct Stat338. Am constatat că IL-6 a promovat același model de polarizare imunosupresoare în celulele mieloide și macrofagele murine și umane pe care l-am observat în macrofagele Itgam-/-/ (Fig. 3b). Împreună, aceste rezultate au sugerat că IL6 autocrină poate conduce polarizarea constitutiv imunosupresoare observată în macrofagele Itgam-/-. În sprijinul acestui concept, reducerea Il6 a diminuat expresia expresiei Pdgfb constitutive în macrofagele Itgam-/-/- (Fig. 3c). Deoarece TAM-urile sunt o sursă majoră de expresie a Il6 în tumori15, aceste rezultate sugerează că CD11b servește ca o frână naturală a supresiei imune în parte prin controlul transcripției celulelor mieloide a Il6.

Familia Let7 de microARN-uri poate controla expresia Il6 în celulele tumorale și inflamatorii40,41. microARN-urile sunt ARN-uri necodificatoare care modulează expresia genelor la nivel post-transcripțional prin interferența cu traducerea sau stabilitatea ARN-ului și pot avea un impact dramatic asupra imunodepresiei tumorale și a angiogenezei42,43. Am constatat că expresia miARN Let7a s-a corelat invers cu expresia Il6 în macrofagele murine și umane (Figura suplimentară 6a-b). Prin urmare, am întrebat dacă pierderea expresiei CD11b în macrofage afectează expresia Let7a. Expresia Let7a a fost diminuată în macrofagele Itgam-/- și în macrofagele transcedate cu siRNA Itgam și în prezența anticorpilor CD11b neutralizanți (Fig. 3d; Figura suplimentară 6c) într-un mod care a fost independent de Lin28, o proteină de legare a ARN care clivează și inactivează Let7, deoarece nivelurile Lin28 nu au fost afectate de expresia sau activarea CD11b (Figura suplimentară 6b, d-e). Ligatura CD11b prin ICAM-1 a promovat expresia Let7a dependentă de timp, inhibând în același timp expresia Il6; invers, suprimarea adeziunii a inhibat expresia Let7a și a promovat expresia Il6 atât în macrofagele murine, cât și în cele umane (Fig. 3e, f). Este important de remarcat faptul că expresia ectopică a miARN Let7a (pre-miARN) a inhibat expresia genelor imunosupresoare și a stimulat expresia genelor proinflamatorii în macrofagele Itgam-/-/, în timp ce anti-miARN Let7a a stimulat expresia genelor imunosupresoare și a inhibat expresia genelor imunostimulatoare în macrofagele WT (Fig. 3g). Similar cu ablația CD11b (Fig. 1a), anti-miARNm Let7a a stimulat expresia Pdgfb, dar nu a avut niciun efect asupra expresiei Vegfa (Fig. 3h). Împreună, aceste rezultate indică faptul că activarea CD11b promovează expresia miARN Let7a, care, la rândul său, inhibă expresia genelor macrofagelor imunosupresoare mediate de IL6.

c-Myc, un factor de transcripție care reglează polarizarea macrofagelor imunosupresoare, se leagă de promotorul Let7 și suprimă transcrierea acestuia; în mod interesant, Let7 poate, de asemenea, să suprime expresia c-Myc44,45. Am constatat că gena c-Myc a fost suprareglementată în macrofagele Itgam-/- în comparație cu macrofagele WT (Fig. 3i). expresia proteinei c-Myc și fosforilarea serinei 62, care stabilizează factorul de transcripție46, au fost, de asemenea, suprareglementate în macrofagele Itgam-/- în comparație cu macrofagele WT (Fig. 3j). Ne-am întrebat apoi dacă inhibarea funcției cMyc ar putea promova expresia Let7 și, astfel, să modifice polarizarea macrofagelor. În mod important, expresia Let7a, Let7d și Let7f a fost redusă în macrofagele Itgam-/-; cu toate acestea, inhibarea farmacologică a c-Myc a restabilit expresia Let7 în macrofagele Itgam-/- și a inversat expresia crescută a genelor imunosupresoare prezentată de macrofagele Itgam-/- (Fig. 3k, l). Împreună, aceste date indică faptul că integrina CD11b funcționează pentru a suprima expresia Myc și polarizarea macrofagelor imunosupresoare într-o manieră dependentă de Let7.

Pentru că Let7a inhibă expresia Pdgfb mediată de macrofage, am investigat efectul expresiei Let7a asupra neovascularizării in vitro și in vivo. Celulele endoteliale și celulele musculare netede vasculare atașate la microsfere purtătoare au fost cultivate în geluri de fibrină care conțineau fie macrofage WT, fie macrofage Itgam-/- care au fost transduși cu miARN de control, pre-miARN Let7a, anti-miARN Let7a sau siARN Pdgfb-bb. Macrofagele Itgam-/- au stimulat alungirea lăstarilor, care a fost inhibată de transducția macrofagelor cu miARN Let7a miARN sau siARN Pdgfb (Fig. 4a, b; Figura suplimentară 6f). În schimb, exprimarea anti-miARN Let7a în macrofagele WT, dar nu Itgam-/-, a stimulat alungirea lăstarilor (Fig. 4a, b; Figura suplimentară 6f). În plus, macrofagele transduși cu anti-miR Let7a au stimulat formarea de vase sanguine mature, acoperite cu pericit în Matrigel saturat cu bFGF in vivo (Fig. 4c). Împreună, aceste studii arată că CD11b controlează neovascularizarea prin reglarea Let7a și expresia ulterioară a PDGF-BB.

Celula mieloidă Let7a reglează progresia tumorală

Pentru a testa rolul Let7a în reglarea supresiei imune tumorale și a neovascularizării, am livrat anti-miR Let7a la tumori în nanoparticule destinate celulelor mieloide in vivo (Fig. 4d). Am constatat că nanoparticulele țintite de integrina αvβ3 au fost preluate în mod specific de celulele mieloide circulante la animalele normale și la cele purtătoare de tumori (Figura suplimentară 7a-h). Livrarea de anti-miARN Let7a a stimulat creșterea tumorii LLC, comparabilă cu cea observată la șoarecii Itgam-/-/- (Fig. 4d). Deși Let7a este exprimat în celulele imune și neimune din tumori, am constatat că livrarea de anti-miRNA Let7a a inhibat doar expresia Let7a în monocitele circulante și în macrofagele asociate tumorii, dar nu și în alte celule asociate tumorii (Fig. 4e). Este important faptul că anti-miRNA Let7a a stimulat expresia genelor imunosupresoare și pro-angiogenice și a inhibat expresia genelor pro-inflamatorii în tumori, comparativ cu controalele (Fig. 4f, Figura suplimentară 8a). Anti-miARN Let7a a stimulat, de asemenea, normalizarea vaselor sanguine în tumorile transfectate, deoarece vasele erau mai lungi, mai puțin ramificate, puternic acoperite cu pericite și mai puțin permeabile decât vasele din tumorile transfectate de control (Fig. 4g, h). Este important faptul că anti-Let7a a suprimat, de asemenea, recrutarea celulelor T CD8+ în tumori și a îmbunătățit recrutarea celulelor T CD4+ în tumori (Fig. 4i). Împreună, aceste rezultate indică faptul că CD11b limitează suprimarea imună și maturarea vasculară prin reglarea miARN Let7a. Studii anterioare au arătat că o normalizare vasculară crescută în tumori poate îmbunătăți perfuzia tumorală și poate promova capacitatea de răspuns la terapie23,24,25,25,26,26,27,28,29,30,31,32,33,33,34,35,36. Pentru a determina dacă normalizarea vasculară indusă de anti-miARN Let7a ar putea spori eficacitatea chimioterapiei prin creșterea perfuziei tumorale, am tratat șoareci purtători de tumori LLC cu administrarea țintită de anti-miARN Let7a sau de miARN de control în combinație cu chimioterapia (gemcitabină) (Fig. 4j). În timp ce anti-miARN Let7a a promovat creșterea tumorii LLC, anti-miARN Let7a combinat cu gemcitabina a redus substanțial creșterea tumorii, în concordanță cu ideea că inhibarea Let7a crește accesibilitatea tumorii la chimioterapie (Fig. 4k). În conformitate cu aceste rezultate, am constatat că tratamentul cu gemcitabină al șoarecilor Itgam-/-/- a suprimat creșterea tumorii mai profund decât tratamentul cu gemcitabină al șoarecilor WT (figura suplimentară 8b). Deoarece Itgam-/-/- a prezentat o perfuzie mai mare (mai puține scurgeri vasculare) decât șoarecii WT (Figura suplimentară 8c), aceste studii indică faptul că CD11b, prin efectele sale asupra miARN Let7a, joacă un rol esențial în reglarea răspunsurilor imunitare și vasculare tumorale.

Agonistul CD11b LA1 inhibă creșterea tumorală

Rezultatele noastre au sugerat că activarea farmacologică țintită a CD11b in vivo ar putea repolariza macrofagele asociate tumorii, cu inhibarea ulterioară a suprimării imunitare a tumorii și a creșterii tumorale. Astfel, am investigat efectele unui agonist cu moleculă mică al CD11b, leukadherin 1 (LA1)47,48 (Fig. 5a), asupra polarizării macrofagelor și a creșterii tumorale. LA1 a stimulat adeziunea celulelor mieloide la substraturile acoperite cu ICAM-1 într-o manieră care a fost inhibată de anticorpii de neutralizare anti-CD11b (Fig. 5b). LA1 a stimulat expresia genelor de răspuns imunitar al macrofagelor, ilustrată prin creșteri ale expresiei ARNm Il1b, Tnfa, Il12, Nos2 și Ifng (figura suplimentară 9a). Deoarece LA1 a stimulat expresia Let7a și a inhibat expresia Pdgfb și Il6 (Fig. 5c), aceste rezultate au sugerat că LA1 ar putea stimula răspunsurile imune pro-inflamatorii care ar putea inhiba creșterea tumorală in vivo. Pentru a evalua efectele LA1 asupra macrofagelor asociate tumorilor in vivo, au fost izolate macrofagele asociate tumorilor10 , tratate cu LA1 înainte și co-implantate cu celule tumorale LLC. Macrofagele tratate cu LA1 au inhibat complet creșterea tumorii (Fig. 5d, e), chiar dacă LA1 nu a avut niciun efect direct asupra LLC sau asupra viabilității macrofagelor (Fig. 5e, f). Deși LA1 nu a avut niciun efect asupra creșterii celulelor tumorale de sân CL66-Luc in vitro (figura suplimentară 9b), LA1 a redus puternic creșterea tumorală în tumorile de sân CL66-Luc singeneice, implantate ortotopic, mai eficient decât taxolul (Fig. 5g). LA1 a creat, de asemenea, o sinergie cu iradierea pentru a suprima creșterea tumorilor mamare CL66-Luc (Fig. 5h) și a suprimat creșterea tumorilor mamare xenograft mamare umane MDA-MB-231 ortotopice (Fig. 5i). Este important faptul că LA1 a inhibat creșterea tumorilor pulmonare LLC murine la șoarecii WT, dar nu și la șoarecii Itgam-/-, ceea ce indică faptul că LA1 acționează prin intermediul integrinei CD11b pentru a suprima creșterea tumorilor (Fig. 5j, k).

Deoarece tratamentul cu LA1 a crescut prezența macrofagelor MHC-II +, considerate în mod obișnuit competente din punct de vedere imunitar, și a scăzut prezența macrofagelor CD206+, considerate în mod obișnuit imunosupresoare, în tumorile LLC și CL66-Luc (Figura suplimentară 9c-d), studiile noastre sugerează că LA1 repolarizează macrofagele asociate tumorii. În consecință, am constatat că LA1 a inhibat expresia S100A8 și MMP9 în celulele CD11b+ în tumorile LLC și, de asemenea, a inhibat expresia Arginase1, S100A8 și MMP9 în tumorile CL66-Luc (Figura suplimentară 9e-f). Deoarece aceste proteine sunt markeri ai macrofagelor pro-tumorale, împreună, aceste studii indică faptul că LA1 inhibă probabil creșterea tumorală prin repolarizarea macrofagelor asociate tumorii. Într-adevăr, tratamentul cu LA1 a crescut prezența celulelor T CD8 + atât în tumorile LLC, cât și în tumorile CL66-Luc (Figura suplimentară 10a-c). Am observat, de asemenea, că tratamentul cu LA1 a modificat neovascularizarea în tumori prin scăderea numărului de vase de sânge SMA + (Fig. 5l). Prin îmbunătățirea profilului imunitar proinflamator al tumorilor și prin inhibarea normalizării vasculare în tumori, agonistul cu moleculă mică CD11b LA1 a modificat în mod semnificativ polarizarea macrofagelor, a crescut recrutarea celulelor T CD8+ în tumori și a inhibat progresia tumorală în modelele de șoareci de cancer murin și uman.

.