Dintre fragmentele de ADN pe care am încercat inițial să le amplificăm, numai tlp2, che1P și cheA1 (tabelul 1) au produs un produs de amplificare PCR fără utilizarea aditivilor solvenți, atunci când ADN genomic de A. brasilense a fost utilizat ca șablon (figura 1). Au fost testate mai întâi efectele DMSO la 1,25 %, 2,5 %, 5,0 %, 7,5 % și 10 %, (w/vol), precum și ale formamidei la concentrații similare ca aditivi în PCR (figura 1). S-a efectuat, de asemenea, un set de PCR cu BSA la 1-10 μg/μl (datele nu sunt prezentate). În concordanță cu datele din literatura de specialitate , în timp ce atât adaosul de DMSO sau de formamidă în PCR a promovat creșterea randamentului de amplificare a fragmentelor de ADN de 2-3 kb, efectul de amplificare al DMSO a fost mai mare decât cel al formamidei (figura 1). În aceste condiții, am observat, de asemenea, că creșterea concentrației de DMSO ar putea duce, de asemenea, la scăderea specificității PCR (figura 2). Pe de altă parte, efectul formamidei în promovarea creșterii randamentului PCR a scăzut pentru fragmente de ADN mai mari de aproximativ 2,5 kb (figura 1). Nu a existat niciun efect semnificativ al adăugării de BSA singur ca aditiv PCR, în aceste condiții, inclusiv niciun efect dăunător (Date neprecizate). Efectele de îmbunătățire a BSA asupra randamentului PCR au fost detectate atunci când a fost utilizat în combinație cu DMSO sau formamidă, pe o gamă largă de dimensiuni ale fragmentelor de ADN (figura 2). În plus, adăugarea de BSA a lărgit intervalul de concentrații pentru care se putea adăuga solventul organic, chiar și pentru șabloanele de ADN de dimensiuni mai mari (figura 2). Consensul din literatura de specialitate actuală privind formamida indică faptul că aceasta este cea mai eficientă ca aditiv PCR atunci când este utilizată la concentrații cuprinse între 0 și 5%, eficacitatea scăzând complet la 10% . Rezultatele noastre indică faptul că, în prezența BSA, formamida este eficientă cel puțin până la concentrații de 10% și cu șabloane de ADN cu o dimensiune de până la 2,5 kb (tlp2); cu toate acestea, nu a reușit să promoveze amplificarea fragmentelor de ADN de dimensiuni mai mari (figura 1). Acest rezultat este în concordanță cu efectul raportat al formamidei ca fiind cel mai eficient pentru amplificarea șabloanelor de ADN de până la aproximativ 2,5 kb și susține în continuare ideea că DMSO și formamida au îmbunătățit randamentul PCR prin mecanisme diferite. Indiferent de aceste diferențe, adăugarea de BSA la această PCR a părut să promoveze și să extindă și mai mult efectele benefice observate atunci când oricare dintre cei doi solvenți a fost utilizat ca aditiv PCR. Având în vedere potențialele efecte negative pe care concentrațiile ridicate de solvenți organici le pot avea asupra aplicațiilor sensibile din aval, cum ar fi secvențierea sau clonarea, efectul de îmbunătățire al adaosului de BSA este semnificativ. Pentru a înțelege mai bine modul în care BSA ar putea acționa ca un co-îmbunătățitor cu DMSO sau formamida, am analizat efectul adaosului său asupra randamentului de amplificare pe parcursul a 10, 15, 20, 25 și 30 de cicluri de PCR. Această analiză a confirmat faptul că adăugarea de DMSO sau formamidă, dar nu și de BSA singur, la PCR duce la creșterea randamentului (figura 3). În cazul în care BSA a fost utilizat ca și co-îmbunătățitor cu DMSO sau formamidă, o creștere a randamentului a putut fi detectată doar în primele 15 cicluri pentru toate șabloanele (figura 3). Această creștere a variat de la o creștere a randamentului de 10,5 % (che1P) la o creștere a randamentului de 22,7 % (cheA1) pe parcursul primelor 15 cicluri. În plus, s-a constatat că concentrația efectivă de BSA crește odată cu dimensiunea fragmentului de ADN amplificat până la o concentrație maximă de BSA (10 μg/μl), unde nu s-a mai detectat nicio creștere a randamentului. În plus, nu s-a observat nicio scădere a randamentului chiar și cu cea mai mare concentrație de BSA adăugată în aceste condiții (figura 4). Efectul de creștere limitat de ciclu al BSA asupra randamentului PCR a sugerat că această proteină poate fi denaturată în timp, pierzându-și astfel eficacitatea. Pentru a testa această ipoteză, a fost configurată o PCR în care DMSO sau formamida a fost combinată cu BSA în tamponul de reacție inițial la cele mai eficiente concentrații determinate mai sus și a fost rulată timp de 10 cicluri înainte de adăugarea unei soluții proaspete de BSA (0-10 μg/μl concentrație finală). Adăugarea de BSA a fost repetată pe parcursul a 30 de cicluri PCR, iar efectul asupra randamentului a fost analizat conform descrierii de mai sus. O creștere susținută a randamentului a putut fi detectată atunci când BSA a fost adăugat la fiecare al zecelea ciclu al PCR: de exemplu, în amplificarea cheA1, s-a obținut o creștere de aproape 75 % a randamentului PCR față de cel obținut cu solventul singur (figura 4). Rezultatele observate în ceea ce numim metoda „etapa PCR cu BSA” sunt în concordanță cu ipoteza că denaturarea BSA determină scăderea efectului de creștere a randamentului după cel de-al cincisprezecelea ciclu al PCR. Experimentele de control în care s-a adăugat glicerol sau apă distilată sterilă la fiecare al zecelea ciclu nu au crescut randamentul PCR, ceea ce indică faptul că efectele BSA nu se datorează unei modificări a volumului de reacție sau faptului că BSA acționează efectiv ca un agent de aglomerare moleculară, o proprietate atribuită unora dintre efectele glicerolului în PCR . Deși nu se cunosc mecanismele exacte ale efectului de creștere a efectului BSA asupra randamentului PCR, datele obținute aici și descrise în literatura de specialitate susțin ipoteza conform căreia BSA poate stabiliza ADN polimeraza și/sau contracara efectele inhibitoare potențiale ale concentrațiilor ridicate de solvenți organici asupra activității ADN polimerazei. Pentru amplificarea cheA4, fragmentul de ADN cu cel mai mare conținut de GC utilizat în acest studiu (73 %), s-a obținut o creștere a randamentului PCR prin adăugarea de BSA, precum și de DMSO la PCR, dar s-au detectat, de asemenea, multiple produse de amplificare nespecifice (figura 5). Pentru a rezolva această problemă, s-a utilizat în continuare metoda de etapă PCR cu BSA în combinație cu un protocol PCR „Touchdown”, care s-a demonstrat anterior că îmbunătățește specificitatea PCR . Această metodă a produs o singură bandă specifică și aproape a dublat randamentul care a fost produs prin utilizarea protocolului „Touchdown” plus solvenți organici singuri (creștere de 96%) (Figura 5). Aceste rezultate ne-au sugerat, de asemenea, o modalitate de a îmbunătăți eficiența relativ scăzută a utilizării metodei de mutageneză dirijată de situs a plasmidelor întregi, descrisă în kitul de mutageneză „QuickChange Stratagene Mutagenesis Kit” (Stratagene), pentru a introduce mutații în unele șabloane de ADN bogate în GC (aici gena tlp2, un fragment de 2,5 kb cu 66% GC). Atunci când am utilizat pUCtlp2 ca șablon pentru mutageneza dirijată de situs, împreună cu primeri mutageni concepuți pentru a introduce o singură pereche de baze de substituție în tlp2 (primeri mutageni concepuți conform site-ului web al producătorului) și protocolul producătorului, fragmentul de 5,324 kb corespunzător pUCtlp2 era abia vizibil (Figura 5). La finalizarea protocolului de mutageneză conform instrucțiunilor producătorului, nu s-a obținut nicio colonie sau s-a obținut un număr mic de colonii (mai puțin de 5 în medie) care conțineau plasmidele parentale care nu aveau mutația dorită. Acest tip de rezultat, caracterizat de un randament slab al mutagenezei, a fost recunoscut anterior ca fiind o capcană comună a acestei metode . Cu toate acestea, atunci când BSA a fost suplimentat în tamponul de fabricație la fiecare cinci etape, a fost detectat în mod clar un produs de amplificare (figura 5). La finalizarea protocolului producătorului, s-au obținut peste 100 de colonii cu 2/3 purtătoare ale mutației dorite (determinate prin secvențiere). Am aplicat, de asemenea, etapa PCR BSA într-un protocol de extensie cu suprapunere pentru a construi o fuziune proteică chimeră între o genă A. brasilense (ATM, 650 bp) și proteina fluorescentă cian (CFP) (720 bp). În cadrul PCR de extensie prin suprapunere, se utilizează mai întâi 2 seturi de perechi de amorsă pentru a amplifica două fragmente de ADN care urmează să fie fuzionate și care sunt produse cu o scurtă secvență de suprapunere una cu cealaltă. O a treia amplificare utilizează produsele de amplificare din primele reacții ca șabloane, împreună cu primerii de inversare și de avansare cei mai îndepărtați, pentru a genera construcții chimerice . Amplificarea celor două fragmente inițiale de ADN, ATM și CFP, a fost foarte eficientă prin utilizarea protocoalelor PCR standard și nu s-a putut obține o creștere semnificativă prin utilizarea protocolului BSA PCR Step (Date neevidențiate). Cu toate acestea, cea de-a doua etapă PCR de suprapunere a produs numeroși produse de amplificare nespecifice și foarte puțin, sau deloc, amplicon chimeric dorit (ATM-CFP; Tabelul 1) (Figura 5). Produsele de amplificare nespecifice au dispărut, atunci când s-a utilizat metoda PCR „Touchdown”, dar ampliconul chimeric specific dorit a rămas în cantitate foarte mică, așa cum a fost detectat printr-o bandă ATM-CFP foarte slabă de 1 370 bp (Figura 5). Utilizarea metodei BSA PCR Step împreună cu un protocol „Touchdown” a dus la o creștere cu 72 % a randamentului ampliconului chimeric ATM-CFP (figura 5). Clonarea și secvențierea ulterioară au confirmat că s-a obținut construcția chimeră corectă.
Efectele DMSO și ale formamidei asupra amplificării PCR a șabloanelor bogate în GC. Exemple tipice de efecte ale adaosului de DMSO și formamidă la diferite concentrații asupra amplificării PCR a șabloanelor de ADN bogat în GC de 2-3 kb. A) Efectul DMSO asupra amplificării PCR a che1P (sus) și tlp2 (jos), așa cum se observă prin electroforeza pe gel a produselor PCR totale. Gelurile au fost colorate cu bromură de etidiu și fotografiate. B) Efectul formamidei asupra amplificării PCR a che1P (sus) și tlp2 (jos) în experimente comparabile.
Efectul de creștere a randamentului PCR al BSA utilizat ca și co-additiv cu solvenții organici. Exemple tipice de efecte ale BSA ca și coaditiv cu DMSO și formamidă, la diferite concentrații, asupra amplificării PCR a șabloanelor de ADN bogate în GC. A) Efectul DMSO asupra PCR de che1P (stânga) și efectul combinat al DMSO cu 6 μg/μl BSA (dreapta), așa cum se observă prin electroforeza pe gel a produsului PCR total. B) Efectele formamidei asupra amplificării PCR a che1P (stânga) și efectul combinat al formamidei cu 6 μg/μl BSA (dreapta) în experimente comparabile.
Efectul adaosului de BSA ca și co-îmbunătățitor cu solvenții organici asupra randamentului PCR. Creșterea randamentului PCR este exprimată în raport cu randamentul PCR obținut fără niciun aditiv. Pe toate panourile, se aplică următoarea legendă: linia roșie, numai DMSO (7,5 %); linia verde, numai formamidă (2,5 %); linia violet, DMSO (7,5 %) și BSA (6 μg/μl); albastru deschis, formamidă (2,5 %) și BSA (6 μg/μl). A) Amplificarea PCR a che1P (392 pb); B) Amplificarea PCR a tlp5P (798 pb); C) Amplificarea PCR a tlp2 (2.638 pb); D) amplificarea PCR a cheA1 (3.389 pb); E) amplificarea PCR a cheOP1 (7.103 pb).
Efectul BSA ca și co-aditiv cu solvenții organici atunci când este suplimentat în etapele intermediare ale PCR. A) Efectul adaosului de BSA asupra randamentului PCR atunci când este adăugat la fiecare zece cicluri pentru fragmente de ADN cu o gamă largă de dimensiuni (de la 392 pb la 7.103 pb); B) Exemplu reprezentativ al efectului adaosului de BSA asupra amplificării PCR a cheA1 (3.389 pb) în prezența DMSO, detectat prin analiza fragmentelor de ADN amplificate prin electroforeză pe gel.
Efectul BSA ca și co-additiv cu solvenți organici în diverse aplicații PCR. A) Un exemplu reprezentativ al efectului adaosului de BSA (BSA Step) ca și coaditiv al efectului DMSO asupra amplificării PCR a cheA4 într-un protocol PCR „Touchdown”, detectat prin electroforeză pe gel. B) Un exemplu reprezentativ al efectului protocolului „BSA Step” utilizat în mutageneza dirijată pe situs (QuickChange site-directed mutagenesis, Stratagene) amplificarea PCR a pUCtlp2, detectat prin electroforeză pe gel. C) Un exemplu reprezentativ al efectului protocolului BSA Step utilizat într-o aplicație PCR de extensie de suprapunere, fuzionând ATM cu CFP pentru a obține ATM-CFP, detectat prin electroforeză pe gel.
.