Canalele și transportorii de ioni clorură: de la curiozități ale naturii și sursă de boli umane la ținte medicamentoase

Acest lucru satisface practic toate cazurile, de la sala de clasă la laboratorul de cercetare, până când luăm în considerare canalele de clorură. Știm că acestea există, sunt importante și ar putea constitui ținte medicamentoase bune în mai multe domenii de boală, dar până de curând au rămas oarecum stigmatizate și demodate în lumea terapeutică. Lipsa liganzilor selectivi nu a ajutat deloc. Singura excepție a fost receptorul GABA-A, care este cuplat la un canal de clorură intrinsec care se deschide la legarea neurotransmițătorului inhibitor GABA. Benzodiazepinele au potențat acest receptor încă de când Valium a devenit disponibil în anii 1960, oferind efecte sedative și anticonvulsivante. Acest lucru introduce un concept important: există mai multe familii de gene și diferite tipuri de proteine care pot fi descrise ca fiind canale de clorură.

Acest lucru este în contrast cu ceea ce înțelegem din canalele ionice selective pentru cationi, unde există puțină flexibilitate în structura proteică ce poate forma un por care este selectiv pentru potasiu, sodiu sau calciu; diversitatea acestor canale ionice este adusă de variațiile din domeniile proteice distincte de por care influențează comportamentul de deschidere-închidere. Ca să fim corecți, nu par să existe multe motive fiziologice pentru care un canal anionic ar trebui să prezinte selectivitate pentru clorură, deoarece există un rol fiziologic redus în transportul membranar al altor halogenuri sau anioni mici; orice canal anionic va fi implicit un canal de clorură din punct de vedere fiziologic. Pe de altă parte, curenții membranari de potasiu, sodiu și calciu joacă fiecare roluri fundamentale diferite, iar permeabilitatea selectivă a membranei la acești cationi este crucială pentru funcția celulară și, într-adevăr, pentru viața însăși.

Receptorii GABA-A sunt membri ai familiilor de canale ionice pentamerice pentamerice cu buclă cys-gatate de ligand, care includ mai multe tipuri de canale excitatori și inhibitori-gatați de neurotransmițători. Proteina CFTR (cystic fibrosis transmembrane regulator) este un canal de clorură reglat de nucleotide. Este membră a diversei familii de transportatori de casete de legare a ATP (ABC) și este singura care nu pare să transporte niciun substrat prin membrană, ci mai degrabă funcționează ca un canal de clorură. Familia CLC de canale de clorură deschise la tensiune provine dintr-o altă familie de gene distincte și are o structură generală unică în rândul proteinelor membranare. Această familie de proteine a adus multe surprize în ultimii 30 de ani, iar membrii acestei familii vor fi prezentați aici și, de asemenea, modul în care ar putea fi considerați ținte medicamentoase.

Alte evoluții interesante din domeniul canalelor de clorură au apărut în urma identificării moleculare a proteinelor care stau la baza canalelor de clorură activate de calciu (ClCa). Din punct de vedere funcțional, cunoaștem de ceva timp rolurile fiziologice ale acestora, dar recenta identificare moleculară a proteinelor canalului a permis dezvoltarea de instrumente moleculare și farmacologice pentru a cerceta și modifica activitatea acestora. Această trecere în revistă se concentrează pe potențialul farmacologic de a viza canalele ClCa și proteinele CLC; funcția și localizarea subcelulară a acestora sunt rezumate în figura 1.

O introducere în proteinele CLC

Cei nouă membri ai acestei familii de proteine sunt CLC-1 la 7, CLC-KA și KB. Membrul fondator, CLC-1, este canalul de clorură pornit în tensiune al mușchiului scheletic și va fi discutat mai jos. Numeroase studii funcționale au fost efectuate asupra unui omolog cu titlul onorific de CLC-0, izolat din organul electric Electroplax, care permite razei să își asmută victimele acvatice. Reconstituirea CLC-0 în bilayere lipidice și înregistrarea electrofiziologică a curenților care circulă prin canale ionice unice a dezvăluit o proprietate intrigantă. De obicei, atunci când se înregistrează curentul dintr-o mică porțiune de membrană care conține un singur canal ionic, se observă fluctuații între două amplitudini de curent: una reprezentând canalul închis și cealaltă reprezentând curentul care circulă prin canalul deschis. Fluctuațiile reflectă tranzițiile între stările cinetice deschise și închise. Cu CLC-0, însă, a fost evident că proteina canalului ionic unic era formată din doi pori echivalenți care se puteau deschide independent1. Prin urmare, acest canal a fost descris ca fiind unul cu două bariere (figura 2). Prin urmare, nu a fost o mare surpriză faptul că structurile cristaline ale omologilor din bacteriile enterice au arătat că complexul proteic era un dimer, fiecare subunitate posedând o cale de conducere ionică2 (figura 2).

A doua surpriză a apărut atunci când au fost efectuate experimente funcționale detaliate asupra CLC-ec1 din E. coli. Mai degrabă decât să funcționeze ca un canal de clorură, ca ruda sa demult pierdută din mușchiul scheletic al vertebratelor, CLC-ec1 este un transportor de schimb 2Cl-/H+, sau antiportor, cu o stoichiometrie strictă de schimb 2:13. Această proteină este importantă pentru supraviețuirea bacteriilor enterice în condiții de pH scăzut4 și este probabil să exploateze un gradient de clorură pentru a menține pH-ul celular la un nivel tolerabil. Prin urmare, CLC procariote ar putea fi ținta unor inhibitori pentru tratarea infecțiilor patogene cu E. coli sau Salmonella4. Descoperirea comportamentului de schimb de ioni a stimulat în mod natural eforturi suplimentare pentru a determina dacă acest schimb de clor pentru protoni există în CLC-urile mamiferelor, pornind de la ipoteza că schimbul Cl-/H+ ar putea fi adevărata funcție a CLC-urilor arhetipale, iar cele identificate ca fiind canale de clorură ar putea fi doar excepții de la regulă. Acest lucru pare să fie adevărat, deoarece există dovezi solide că de la CLC-3 până la CLC-7 funcționează ca transportatori de schimb 2Cl-/H+, care rezidă în principal în organite intracelulare, în timp ce CLC-1, CLC-2, KA și KB sunt adevărate canale ionice conducătoare de clorură pe membrana plasmatică5-9. Deoarece proprietatea arhetipală a CLC este transportul de schimb, care se găsește în toate formele de viață celulară, ultima subclasă de proteine, canalele de clorură de bună credință, pot fi, prin urmare, considerate transportoare de clorură „rupte”, care au pierdut cuplarea transportului de clorură cu mișcarea unui al doilea ion substrat.

CLC-1

Acest fondator al familiei CLC este canalul de clorură pornit în tensiune al mușchiului scheletic și servește la reglarea potențialului membranar și la repolarizarea membranei în urma potențialelor de acțiune pentru a relaxa mușchiul. În majoritatea țesuturilor, ne-am aștepta ca canalele de potasiu să joace acest rol, lucru pe care îl fac în mușchiul cardiac și neted, precum și să regleze excitabilitatea membranară în alte tipuri de celule. Sistemul tubular transversal este o extensie a membranei plasmatice (sarcolema) și pătrunde în țesutul contractil. Acesta este esențial pentru răspândirea rapidă a activității electrice în tot mușchiul și orchestrează contracția rapidă și controlată. Efectul de potasiu din celulele musculare în spațiul limitat al tubului T ar crește concentrația extracelulară de potasiu și ar prăbuși acest gradient ionic, ceea ce ar duce la o depolarizare prelungită a membranei. Deoarece canalele de clorură joacă rolul predominant de repolarizare, acest lucru este împiedicat. Mutațiile de pierdere a funcției CLC-1 duc la miotonie la om, capre și șoareci (pentru o analiză recentă, a se vedea10) și se caracterizează printr-o relaxare musculară afectată, în concordanță cu pierderea unui curent de repolarizare a membranei.

Cu o expresie limitată la mușchiul scheletic, CLC-1 ar putea fi o țintă atractivă pentru medicamentele care controlează contracția musculară prin creșterea sau scăderea funcției CLC-1 și, prin urmare, reduc sau, respectiv, cresc excitabilitatea musculară. Compușii care cresc funcția CLC-1 ar putea fi capabili să trateze miotonia, în special în cazurile în care ar putea compensa pierderea parțială a activității canalelor de clorură. Inhibarea CLC-1 ar putea reduce pragul de contracție musculară și ar putea fi utilă în cazurile de slăbiciune musculară sau de boli degenerative, cum ar fi distrofia musculară.

CLC-2

Canalul de clorură care rectifică spre interior, CLC-2, are o distribuție tisulară oarecum extinsă. Poate fi găsit în neuronii centrali, unde reglează activitatea neuronală11-13. În astrocite, direcționarea sa subcelulară către joncțiunile celulare este reglată de o interacțiune cu GlialCAM (MLC1), ale cărui mutații perturbă această direcționare și cauzează leucoencefalopatia megalencefalică14. Interesele terapeutice recente implică expresia CLC-2 în mucoasa intestinală și în bronhiole pulmonare, unde joacă un rol în secrețiile intestinale și, respectiv, pulmonare. S-a propus ca lubiprostona, un medicament utilizat clinic pentru ameliorarea constipației, să își exercite efectul prin activarea CLC-2, dar acest efect este controversat. În timp ce acest compus activează canalele CLC-2 în unele studii, în altele reglează traficul CLC-2 și crește funcția CFTR prin activarea receptorilor de prostaglandină15,16. Cu toate acestea, rămân suficiente dovezi că creșterea funcției CLC-2 la nivelul căilor respiratorii ar putea oferi o cale alternativă de clorură în fibroza chistică17.

CLC-KA/KB

Celelalte canale de clorură sunt exprimate în mod deosebit în epiteliile renale și contribuie la permeabilitatea membranelor celulare la fluxul pasiv de clorură. Aceștia au un rol cheie în membrul ascendent și în tubulii distali ai nefronului, asigurând o cale bazolaterală pentru reabsorbția clorurii, în urma transportului din urina primară prin membrana apicală. Gena CLCKB, care codifică CLC-KB, este una dintre cele cinci gene care stau la baza sindromului Bartter. Mutațiile de pierdere a funcției în CLC-KB au ca rezultat o reabsorbție defectuoasă a clorurii, ceea ce duce la o tulburare de consum de sare, asociată cu poliurie. Una dintre principalele caracteristici ale persoanelor care sunt afectate de mutațiile CLC-KB (tipul III al sindromului Bartter) este tensiunea arterială scăzută. O formă mai severă a bolii este cauzată de mutații în gena BSND (tipul IV Bartter), care codifică Barttin, o proteină accesorie importantă pentru traficul atât al CLC-KA, cât și al KB către membrana plasmatică18. Această formă a bolii include, de asemenea, surditatea senzorială, despre care se crede că este cauzată de pierderea traficului atât al CLC-KA, cât și al KB către membranele epiteliale din urechea internă. Se presupune că pierderea fie a activității CLC-KA, fie a KB, dar nu a ambelor, poate fi tolerată de sistemul auditiv. Acest lucru sugerează că inhibitorii selectivi fie pentru CLC-KA, fie pentru CLC-KB, sau inhibarea parțială a ambelor, pot acționa ca un nou diuretic cu buclă, cu potențialul de a reduce tensiunea arterială și cu puține efecte secundare. Acest lucru a dus la studierea farmacologiei acestora și la dezvoltarea unor noi derivați de inhibitori cu afinitate micromolară scăzută19 , care au avut efecte diuretice atunci când au fost administrați la șobolani20. Pe de altă parte, medicamentele care activează canalele CLC-KB pot spori activitatea reziduală a canalelor defecte la pacienții cu Bartter de tip III.

CLC-7

Din subclasa transportatorilor de schimb 2Cl-/H+, CLC-7 este o țintă promițătoare pentru acțiunea medicamentoasă, iar inhibarea sa poate fi benefică în osteoporoză. Încă o dată, această indicație își are originea în observațiile privind boala umană cauzată de mutații de pierdere a funcției în CLC-7, care provoacă osteropetroza21. În această afecțiune, remodelarea osoasă de către osteoclaste este deficitară, despre care se crede că este cauzată de secreția defectuoasă de acizi și enzime. Acest lucru duce la un os dens, care, dacă ar fi reprodus cu ajutorul unui inhibitor CLC-7, ar putea reduce dizolvarea osului și, prin urmare, ar putea consolida scheletul pacienților cu osteoporoză22,23. În studiile de validare a conceptului, inhibarea farmacologică a acidificării24 sau întreruperea funcției CLC-7 prin anticorpi25 a redus resorbția osoasă. Cu toate acestea, este posibil ca inhibarea CLC-7 să nu fie lipsită de complicații, deoarece studiile la om și la șoarece sugerează că lipsa funcției CLC-7 poate fi, de asemenea, asociată cu tulburări de depozitare și degenerare neuronală din cauza reducerii funcției lizozomiale26.

Mutații umane cu pierdere de funcție – lecții de la CFTR

Merită o scurtă pauză în acest punct pentru a lua în considerare faptul că unele dintre indicațiile terapeutice pentru noile medicamente care vizează CLC urmăresc să trateze tulburări distincte și aflate la capătul opus al spectrului față de cele care sunt cauzate de funcția CLC defectuoasă. În plus față de cele descrise mai sus, boala Dent I este o boală renală legată de X care este cauzată de pierderea funcției CLC-5 (a se vedea27 pentru o analiză recentă). Toate sunt afecțiuni ereditare rare și un defect proteic major implică fie o activitate redusă a proteinei, fie traficul către membrana țintă. De fapt, multe mutații individuale cauzează reținerea în ER și o lipsă de maturare a proteinei. S-ar putea face o paralelă cu fibroza chistică, majoritatea indivizilor afectați posedând mutația ΔF508 care reține ER. Abordările recente și stratificate pentru tratarea fibrozei chistice au fost rezultatul unui atac pe două fronturi pentru a corecta plierea proteinei mutante (corectori CF) și/sau pentru a crește activitatea canalelor de clorură CFTR din membrana plasmatică (potențiatori CF). Se conturează un succes în cazul clasei de potențiatori28, care sunt eficienți la pacienții cu mutații care reduc activitatea CFTR fără pierderea biosintezei sau a traficului de proteine (de exemplu, G551D), însă eficacitatea corectorilor de pliere (care este necesară în majoritatea cazurilor) rămâne de stabilit29. Deși bolile asociate cu pierderea funcției CFTR sunt toate tulburări genetice rare, s-ar putea ca într-o zi să putem trata persoanele cu miotonie, sindromul Bartter, boala Dent și osteopetroză, precum și cu fibroză chistică, cu medicamente care să corecteze cauza reală a tulburării lor.

Canalele de clorură activate de calciu

În cele din urmă, se vor menționa canalele de clorură activate de calciu (ClCa), care au roluri fiziologice clar definite într-o serie de tipuri de celule, însă identificarea lor moleculară a suferit câteva începuturi false și bâlbâite. Povestea implică patru tipuri de proteine: membri ai familiilor de gene CLCA, Bestrophin, Tweety și TMEM16. În toate cazurile, supraexprimarea lor recombinantă a dus la generarea de curenți de clorură membranari care sunt stimulați prin creșterea concentrației intracelulare de calciu și, în diferite grade, prin depolarizarea membranei. Călătoria pentru CLCA s-a încheiat atunci când s-a constatat că aceasta era o proteină care era secretată, dar care, de asemenea, probabil, amplifica expresia membranară a canalelor ClCa endogene sistemului de expresie30. Proteinele Tweety și Bestrophin nu prezintă toate proprietățile canalelor ClCa studiate în țesuturile principale, deși Best1 pare a fi responsabil pentru o componentă a ClCa în neuronii senzoriali31 și poate fi, de asemenea, un regulator important al eliberării de calciu din reticulul endoplasmatic32,33. Trei studii independente au propus TMEM16A (numit și Ano1) ca fiind un candidat pentru o componentă majoră, dacă nu în întregime, pentru un canal de clorură activat de calciu34-36. Multe studii ulterioare, facilitate de generarea de instrumente moleculare, au susținut acest lucru. TMEM16A este important pentru reglarea excitabilității membranare în mușchiul neted vascular, este suprareglementat într-un model animal de hipertensiune pulmonară și tonusul poate fi redus prin inhibarea canalului37,38. În neuronii senzoriali, TMEM16A asociază prezența mediatorilor inflamatori cu hiperexcitabilitatea membranară, iar inhibarea TMEM16A are efecte antinociceptive39. În modelele animale de astm, expresia acestui canal de clorură special este crescută, iar inhibarea sa poate avea efecte benefice40. Acesta se găsește, de asemenea, în celulele interstițiale Cajal din intestin, iar funcția canalului este necesară pentru contracția ritmică a mușchilor netezi din peretele intestinal41. În plus, activarea TMEM16A poate oferi o cale alternativă pentru secreția epitelială de clorură în fibroza chistică42. În timp ce există încă unele dezbateri cu privire la funcția exactă a restului familiei TMEM16, funcția ClCa a fost atribuită, de asemenea, TMEM16B (Ano2), despre care se crede că stă la baza canalului ClCa din celulele ciliate olfactive43,44. Este posibil să existe, de asemenea, roluri pentru această clasă de canale ionice în biologia celulelor canceroase, iar inhibarea sa poate preveni proliferarea celulară45-48.

Observații finale

Această trecere în revistă a evidențiat diversele roluri ale proteinelor conducătoare sau transportoare de clorură și modul în care disfuncția lor este cuplată la tulburări umane sau la simptome asemănătoare bolilor în modelele animale. Există o lipsă severă de reactivi farmacologici care să inhibe, să activeze sau să îmbunătățească traficul membranar al canalelor și transportatorilor de clorură. Se înregistrează progrese în ceea ce privește medicamentele care inversează funcția defectuoasă a CFTR în fibroza chistică, ceea ce, se speră, va duce la medicamente specifice pentru diferitele tipuri de mutații moștenite. Inhibitorii și activatorii canalelor de clorură activate de calciu TMEM16A42,49 se dovedesc a fi instrumente de laborator utile, iar noii compuși ar putea fi medicamente eficiente, în special dacă pot produce efecte specifice pentru fiecare țesut în parte. Moleculele specifice pentru anumite CLC-uri sunt probabil cele mai evazive. Înțelegerea bazei structurale a activării CLC-ului de tip voltage-gated50 ar putea identifica domeniile proteice care pot fi țintite prin proiectarea rațională a medicamentelor bazate pe structură. Astfel de instrumente ne vor permite să punem la încercare unele dintre ideile terapeutice noi care au fost analizate și prezentate aici.

Biografie autor

Dr. Jon Lippiat și-a finalizat doctoratul privind structura, funcția și farmacologia canalelor de potasiu la Universitatea din Leicester. A studiat funcția celulelor beta pancreatice și diabetul la Universitatea din Oxford înainte de a fi numit conferențiar de farmacologie la Universitatea din Leeds. Cercetările sale implică elucidarea proprietăților structurale și fiziologice ale mai multor tipuri diferite de canale și transportatori de ioni, precum și potențialul lor de a fi țintite de noi reactivi farmacologici.

.