Cercetați să începeți să folosiți probe de sânge în cercetarea dumneavoastră translațională? Poate că sunteți interesat de cancerul de sân metastatic sau de cancerul pulmonar fără celule mici. Sau poate că provocările și limitările eșantioanelor de tumori solide v-au făcut să vă gândiți… a sosit momentul.
Și acum ce facem?
Să aruncăm o privire mai atentă la randamentul ADN și la realitatea de a lucra cu ADN fără celule din plasmă. ADN-ul liber de celule (sau cfDNA) se referă la tot ADN-ul neîncapsulat din fluxul sanguin. O parte din acest ADN liber de celule provine dintr-o clonă tumorală și se numește ADN tumoral circulant (sau ctDNA). cfDNA sunt fragmente de acid nucleic care intră în fluxul sanguin în timpul apoptozei sau necrozei. În mod normal, aceste fragmente sunt curățate de către macrofage, dar credem că supraproducția de celule în cancer lasă în urmă o cantitate mai mare de cfDNA. Aceste fragmente au o lungime medie de aproximativ 170 de baze, au un timp de înjumătățire de aproximativ două ore și sunt prezente atât în stadii incipiente, cât și în stadii târzii, în multe tumori comune, inclusiv cele pulmonare și mamare fără celule mici. Acestea fiind spuse, concentrația de cfDNA variază foarte mult, apărând între 1 și 100.000 de fragmente pe mililitri de plasmă.
Dacă sunteți de ceva vreme în spațiul de secvențiere de ultimă generație, este posibil să doriți să știți despre sensibilitate și specificitate. Am demonstrat o sensibilitate și o specificitate ridicată pentru variantele cu o frecvență mai mare de punctul unu la sută cu 20 de nanograme de ADN de intrare și mai mare de punctul cinci la sută cu 5 nanograme . Pentru a vedea mai multe despre cum se face acest lucru, consultați videoclipul nostru despre testele cfDNA. Este posibil să fi auzit despre utilizarea cfDNA pentru analize la punctul zero unu la sută limita de detecție. În timp ce tehnologia există pentru a ajunge la 0,01% (picături digitale, de exemplu), există o limită biologică despre care trebuie să vorbim.
Dintr-o probă de sânge de 10 ml, utilizând kitul de izolare a ADN-ului fără celule Applied Biosystems MagMAX, obținem în mod obișnuit aproximativ 20 de nanograme de cfDNA, sau aproximativ 6 molecule utilizabile pentru analiză. Câteva calcule rapide ne arată că, la o limită de detecție de 1%, ne putem aștepta la aproximativ 25 de molecule. La o limită de detecție de 0,1% se așteaptă să fie prezente doar 2-3 molecule. Aceasta înseamnă că sub 0,1% este posibil să nu fie prezentă nicio moleculă pentru analiză. Amintiți-vă, de asemenea, că concentrațiile de cfDNA sunt foarte variabile. Acestea pot fi foarte scăzute în stadii critice, cum ar fi recidiva timpurie sau dezvoltarea rezistenței, unde se concentrează acum mulți cercetători. Pentru a izola cu succes 20 de nanograme de ADN din plasma sanguină, sunt disponibile atât metode manuale, cât și automate, în funcție de nevoile dvs. de randament.
ADN în mână, cercetarea dvs. dictează ce cale să urmați în acest moment. Ați putea alege PCR digitală pentru studii de monitorizare a recurenței. Pentru cercetări privind selecția terapiei, ar putea fi preferat un test de secvențiere de generație următoare. Oriunde vă va duce cercetarea biopsiei lichide, vă putem ajuta să ajungeți acolo cu soluții complete pentru analiza cfDNA, de la doar câteva ținte până la teste multi-gene.
Sperăm că v-am oferit câteva lucruri la care să vă gândiți atunci când luați în considerare utilizarea ADN-ului fără celule în laboratorul dumneavoastră. Dar sunt sigur că veți avea câteva întrebări. Așa că trimiteți întrebările dvs. la thermofisher.com/ask și abonați-vă la canalul nostru pentru a vedea mai multe videoclipuri ca acesta. Și nu uitați, atunci când aveți îndoieli, doar secvențiați-l!
.