Laine nu s-a apucat de cântat în mod profesionist până la jumătatea vârstei de douăzeci de ani. Influențele ei timpurii ca și cântăreață au fost Ella Fitzgerald, Sarah Vaughan, Judy Garland și Lena Horne. La vârsta de 24 de ani, a dat o audiție de succes pentru micul grup al lui John Dankworth, Dankworth Seven, și mai târziu pentru orchestra acestuia, cu care a cântat până în 1958. Dankworth și Laine s-au căsătorit în acel an, în secret, la Hampstead Register Office. Singurii martori au fost prietenul cuplului, pianistul Ken Moule, și aranjorul lui Dankworth, David Lindup. Cuplul a avut doi copii, care sunt amândoi muzicieni de succes pe cont propriu: Alec, care locuiește în SUA, și Jacqui, o cântăreață britanică care a lansat o serie de albume.
A jucat rolul principal într-o nouă piesă la Royal Court Theatre din Londra, casa noului val de dramaturgi din anii 1950, precum John Osborne și Harold Pinter. Acest lucru a dus la alte apariții pe scenă, cum ar fi musicalul Valmouth în 1959, piesa A Time to Laugh (cu Robert Morley și Ruth Gordon) în 1962, Boots With Strawberry Jam (cu John Neville) în 1968 și, în cele din urmă, la rolul Julie La Verne în producția lui Wendy Toye din Show Boat la Teatrul Adelphi din Londra în 1971. Show Boat a avut cea mai lungă stagiune de până acum în acel sezon londonez, cu 910 reprezentații puse în scenă.
În această perioadă, a avut două succese discografice majore. „You’ll Answer to Me” a ajuns în Top 10 britanic, în timp ce Laine a fost „prima donna” în producția Festivalului de la Edinburgh din 1961 a operei/baletului The Seven Deadly Sins de Kurt Weill, regizată și coregrafiată de Kenneth MacMillan. În 1964, albumul „Shakespeare and All that Jazz” cu Dankworth a fost bine primit. Dankworth și Laine au fondat teatrul Stables în 1970 în ceea ce a fost vechiul bloc de grajduri din incinta casei lor. A fost un succes imediat, cu 47 de concerte susținute în primul an.
Activitățile internaționale ale lui Laine au început în 1972, cu un prim turneu de succes în Australia, unde a lansat șase albume de top 100 de-a lungul anilor 1970. La scurt timp după aceea, cariera ei în Statele Unite a fost lansată cu un concert la Lincoln Center din New York, urmat în 1973 de prima dintre numeroasele apariții la Carnegie Hall. În curând au urmat turnee din coastă în coastă în SUA și Canada și, odată cu acestea, o succesiune de albume discografice și apariții la televiziune, inclusiv The Muppet Show în 1977. Acest lucru a dus, după mai multe nominalizări, la primul ei premiu Grammy, ca recunoaștere a înregistrării live a concertului ei de la Carnegie din 1983. Ea a continuat să facă turnee periodice, inclusiv în Australia în 2005.
A colaborat cu James Galway, Nigel Kennedy, Julian Lloyd Webber și John Williams. Alte înregistrări importante în această perioadă au fost albumele de duete cu Ray Charles (Porgy and Bess), precum și Pierrot Lunaire de Arnold Schoenberg, pentru care a primit o nominalizare la Premiile Grammy.
Relația lui Laine cu teatrul muzical a început în Marea Britanie și a continuat în Statele Unite cu roluri principale în A Little Night Music de Sondheim și The Merry Widow de Franz Lehár (Michigan Opera). În 1980 a jucat în Colette, un musical de Dankworth. Spectacolul a început la teatrul Stables, Wavendon, în 1979 și a fost transferat la Comedy Theatre, Londra, în septembrie 1980. În 1985 a interpretat rolul Prințesei Puffer în musicalul de pe Broadway The Mystery of Edwin Drood, pentru care a primit o nominalizare la Tony. În 1989 a fost aclamată de criticii din Los Angeles pentru interpretarea vrăjitoarei din spectacolul Into the Woods de Sondheim.
În mai 1992, Laine a apărut alături de Frank Sinatra pentru o săptămână de concerte la Royal Albert Hall din Londra.
Până la sfârșitul anilor 1990, concertele lui Laine au fost sold out în toată lumea, de obicei susținute de Dankworth cu trupa, orchestra sau grupul său mai mic. Trupa ei obișnuită îi includea pe John Horler (pian), Alec Dankworth (bas), Allan Ganley (tobe) și Mark Nightingale (trombon).
Autobiografia lui Laine, Cleo, a fost publicată în septembrie 1994 de Simon & Schuster. A doua ei carte, You Can Sing If You Want To, a fost publicată de Victor Gollancz în octombrie 1997. În 2000, ea a apărut în rolul vocalistei Gwen în filmul The Last of the Blonde Bombshells.
În lista onorurilor de Anul Nou din 1997, Laine a devenit Dame Commander, iar ea a fost numită Dame Cleo Laine DBE. În lista onorurilor de Anul Nou 2006, soțul ei a fost făcut cavaler burlac, devenind Sir John Dankworth. Ei au fost unul dintre puținele cupluri în care ambii parteneri au deținut titluri de sine stătătoare și singurul cuplu din jazz care a fost astfel recunoscut.
Dankworth a murit la 6 februarie 2010, cu câteva ore înainte de un concert planificat la teatrul Stables din Wavendon pentru a sărbători cea de-a 40-a aniversare a localului. El era bolnav de mai multe luni, după un turneu de concerte în Statele Unite. În ciuda durerii sale, Laine a cântat la concertul de aniversare a 40 de ani, alături de John Dankworth Big Band și de mai mulți membri ai familiei sale – anunțându-și moartea abia la final. Decizia lui Laine de a cânta a apărut pe primele pagini ale ziarelor din întreaga lume, inclusiv o fotografie integrală cu ea pe prima pagină a ziarului The Times.
La o săptămână după moartea lui Dankworth, Laine i-a luat locul regretatului ei soț și a apărut din nou în concert la Pinner, în nord-vestul Londrei. Laine a continuat să cânte și să dea interviuri în lunile care au urmat morții lui Dankworth. Ea a apărut ca cap de afiș la festivalul Music in the Garden de la Wavendon în iunie și iulie 2010.
În martie 2010, ultima colaborare muzicală a lui Laine și Dankworth a fost lansată pe CD și pentru descărcare – Jazz Matters. Înregistrarea a prezentat Dankworth Big Band interpretând noi compoziții scrise de Dankworth pentru interpretarea cuplului la Proms 2007 la Royal Albert Hall.
Laine este renumită nu numai pentru stilul său interpretativ, ci și pentru gama sa de aproape patru octave și adaptabilitatea vocală. Pe lângă faptul că atinge note profunde și pline de suflet, scattingul și notele de top ale lui Laine au devenit semnătura ei. Deși gama ei naturală este cea a unui contralto, ea este capabilă să producă un Sol peste Do acut. Derek Jewel de la Sunday Times a numit-o „pur și simplu cea mai bună cântăreață din lume.”
.