Animale
S. purpuratus au fost menținute în apă de mare artificială la 14 °C. L. anatina au fost colectate în iunie 2016 în zonele umede Xiangshan, districtul Xiangshan, orașul Hsinchu, Taiwan (coordonatele GPS 24.770779, 120.910742 E), transportate la laborator pe gheață și apoi disecate imediat.
Construcții și plasmide
Pentru a determina activitatea enzimatică a SpAIDLs și LaAIDLs, s-au generat vectorii de expresie bacteriană respectivi pASK-SpAIDLX/LaAIDLX/HsAID pentru SpAIDL1, 2, 3, 4a, 9, LaAIDL1, 2 și HsAID. Cadrele de lectură deschise ale fiecărei SpAIDL au fost amplificate din ADN genomic prin PCR folosind polimeraza Phusion și amorse care conțin situsurile de restricție SpeI și XhoI (tabelul suplimentar 1). Produsele PCR au fost digerate cu SpeI și XhoI (New England Biolabs) și inserate în situsurile NheI/XhoI din pASK-TadA (un cadou de la Dr. Nina Papavasiliou, Universitatea Rockefeller, New York), înlocuind cadrul de citire deschis TadA. Pentru SpAIDL9, această strategie de clonare a schimbat al treilea aminoacid de la fenilalanină la serină, iar această mutație F3S a fost readusă la F3 cu ajutorul kitului de mutageneză Quikchange (Stratagene) cu primeri SPA9S3FT/SPA9S3FB (tabelul suplimentar 1). HsAID a fost amplificat dintr-o plasmidă care conține AID uman de lungime completă (pCDF-AID, un cadou de la Dr. Nina Papavasiliou, Universitatea Rockefeller, New York). Strategia de clonare a schimbat al doilea aminoacid din aspartat în alanină, iar D2A a fost transformat din nou în D2 cu ajutorul kitului de mutageneză Quikchange (Stratagene) cu primeri hAIDA2DT/hAIDA2DB (tabelul suplimentar 1). PASK-ul gol a fost generat prin digestia NheI/XhoI a pASK-TadA, umplerea suprapunctelor cu ajutorul polimerazei Klenow și ligarea cu ADN ligază T4 (Thermo Scientific). Cadrele de lectură deschise ale fiecărui LaAIDL au fost amplificate din ADNc din L. anatina și clonate în vectorul de clonare pJET1.2/blunt (Thermo Scientific). Cadrele deschise de citire LaAIDLX au fost excizate cu SpeI și XhoI (New England Biolabs) și clonate în situsurile XbaI/XhoI din pASK_V5-SpAID4a (descrise mai jos), înlocuind inserția SpAID4a. Trebuie remarcat faptul că fragmentele clonate conțin codonii de oprire originali la capetele lor 3′, astfel încât proteina exprimată nu conține o etichetă V5.
Constructele de expresie pentru mutanții de situs activ ai SpAIDL1 și LaAIDL1 (SpAIDL1 H86R E88Q, SpAIDL1 H86R E88Q C123A C126A, și LaAIDL1 H81R E83Q H298R E300Q) au fost generate prin mutageneză dirijată de situs din plasmidele respective de tip sălbatic (sau mutant unic) utilizând fie kitul de mutageneză Quikchange (SPA1H85RE87QT/SPA1H85RE87QB pentru SpAIDL1 RQ), fie prin PCR convențional, utilizând primeri 5′-fosforilați (SPA1CCAA-P/SPA1CCAAB pentru cel de-al doilea set de modificări în SpAIDL1 RQAA și LaA1H81RE83QB/LaA1H81RE83Q-P și LaA1H298RE300QB/LaA1H298RE300Q-P pentru SpLaAIDL1 RQRQ), urmată de digestia DpnI, ligarea pentru circularizarea produselor și transformarea în E. competent. coli.
Pentru a monitoriza nivelul de expresie a proteinei recombinante în E. coli, au fost create construcțiile de expresie bacteriană pASK_V5-SpAIDLX/LaAIDLX/HsAID. pASK_V5 a fost generat prin aneantizarea oligonucleotidelor pASK_V5F/pASK_V5R (tabelul suplimentar 1) care conțin secvența de etichetare V5 și ligarea lor în situsurile NheI/SalI din pASK-TadA. Plasmidele pASK-SpAIDLX/LaAIDLX au fost utilizate ca șabloane pentru amplificarea ADNc-urilor respective fără codon de oprire, utilizând polimeraza Phusion și amorsele enumerate în tabelul suplimentar 1, și clonate în situsurile NheI/XhoI (pentru fragmentele SpAIDLX și HsAID) sau XbaI/XhoI (pentru fragmentele LaAIDLX) din pASK_V5. HsAID a fost amplificat din pASK-hAID. Secvențele ambelor, SpAIDL9 și HsAID, au fost din nou modificate de această strategie de clonare și au fost schimbate înapoi la secvențele corecte, așa cum s-a descris mai sus.
Prepararea ADN-ului genomic
ADN-ul genomic al ambelor, S. purpuratus și L. anatina, a fost purificat cu ajutorul kitului gDNA Spin Kit Tissue (Bioman), conform instrucțiunilor producătorului. Pe scurt, aproximativ 1 × 106 de celomocite S. purpuratus și 100 mg de țesut L. anatina au fost adăugate în tuburi de microcentrifugare separate, omogenizate în 200 µl de tampon GT (Bioman) conținând 200 mg de proteinază K și incubate timp de 30 de minute la 60 °C pentru a liza complet celulele. După adăugarea a 200 µl de tampon BG (Bioman), probele au fost vortexate și incubate timp de 20 de minute la 70 °C. Ulterior, s-au adăugat 200 µl de etanol și întreaga probă a fost încărcată pe o coloană de centrifugare GD (Bioman). S-au efectuat spălări cu 400 µl de soluție tampon WI (Bioman) și 600 µl de soluție tampon de spălare prin centrifugare la 10 000 × g timp de 30 s. Aceasta a fost urmată de eluția ADN-ului genomic cu 100 µl de soluție tampon de eluție (10 mM Tris pH = 8,0) care a fost preîncălzită la 60 °C.
Prepararea ARN-ului și sinteza ADNc
S. purpuratus lichidul celomic a fost extras cu o seringă prin membrana periostomală și amestecat imediat cu un volum egal de CMSFW-EI (0,53 M NaCl, 10 mM KCl, 2,4 mM NaHCO3, 11 mM Na2SO4, 30 mM EDTA, 50 mM imidazol). Celomocitele au fost centrifugate și resuspendate în 800 μl de EasyPure Total RNA Reagent (Bioman). Esofagul, intestinul subțire, intestinul gros și gonadele de la S. purpuratus și pediculul, cecumul digestiv, gonadele și intestinul de la L. anatina au fost disecate de la animale individuale. Bucăți mici de țesuturi solide din S. purpuratus și L. anatina au fost adăugate la 200 μl de reactiv EasyPure Total RNA Reagent (Bioman), iar probele au fost omogenizate într-un Bullet Blender (Next Advance) cu ajutorul unor bile de ZrO de 0,5 mm. Resturile insolubile au fost centrifugate, iar supernatanții au fost transferați în tuburi noi care conțineau 600 μl de EasyPure Total RNA Reagent (Bioman) și 200 μg de glicogen ca suport. ARN total a fost apoi purificat în conformitate cu protocolul producătorului. Pentru a elimina ADNg rezidual și alți contaminanți, ARN-ul S. purpuratus a fost apoi prelucrat în continuare folosind fie kitul Turbo DNA-free (Ambion), fie kitul RNeasy mini (Qiagen). Kitul Turbo DNA-free (Ambion) a fost utilizat în conformitate cu protocolul producătorului, cu excepția faptului că s-au adăugat MgCl2 (2,5 mM) și CaCl2 (1 mM) în plus pentru digestia cu DNază. Kitul RNeasy mini (Qiagen) a fost utilizat în conformitate cu protocolul producătorului.
Aproximativ 250-500 ng de ARN de S. purpuratus și L. anatina din fiecare țesut au fost convertite în ADNc utilizând sistemul RT-PCR ThermoScript (Invitrogen) sau, respectiv, kitul RT rapid ToolsQuant II (Biotools). În ambele cazuri, s-au folosit hexameri aleatori și s-au urmat instrucțiunile producătorului.
Amplificarea rapidă a capetelor ADNc
Terminalele 5′ și 3′ ale transcriptelor SpAIDL9 au fost amplificate folosind kitul SMARTer RACE (Clontech) și primerii specifici genei SPA9CR1, SPA9CR2, SPA9CF1, SPA9CF2 (a se vedea tabelul suplimentar 2) în conformitate cu instrucțiunile producătorului. Produsele PCR care conțin capetele 5′ și 3′ ale transcriptelor au fost clonate în vectorul de clonare pJET1.2/blunt (Thermo Scientific), iar clonele individuale au fost secvențiate în întregime.
Analiză secvențială a genelor SpAIDL
ADN genomic din trei gene S. purpuratus (Sp105, Sp111, Sp112) au fost folosite ca șabloane pentru a amplifica cadrele deschise de citire ale SpAIDL1, 2, 3, 4a, 9 folosind polimeraza Phusion și amorsele enumerate în tabelul suplimentar 2. Produsele PCR au fost clonate în vectorul de clonare pJET1.2/blunt (Thermo Scientific). Plasmidele au fost purificate cu ajutorul kitului Tools mini plasmid (Biotools) și au fost trimise la un serviciu comercial (Genomics Taiwan) pentru secvențiere folosind fie primerii pJET1.2 forward, fie primerii pJET1.2 reverse.
Au fost colectate cel puțin opt secvențe pentru fiecare genă de la fiecare arici de mare, iar secvențele de primer au fost excluse înainte de alinierea secvențelor. Secvențele de nucleotide pentru fiecare genă au fost mai întâi aliniate în cadrul fiecărui S. purpuratus folosind CLUSTALW (www.genome.jp/tools/clustalw), iar secvențele dominante care corespund celor două alele au fost apoi selectate pentru a fi comparate ulterior între arici de mare individuali.
Analiza expresiei genelor
DNA complementar din trei indivizi S. purpuratus (Sp146, Sp147, Sp148) și doi indivizi L. anatina (La1 și La3) au fost utilizați ca șabloane pentru a testa expresia fie a SpAIDL1, 2, 3, 4a și 9, fie a LaAIDL1 și 2 prin PCR cantitativă. Fiecare reacție qPCR (10 μl) a conținut 5 μl de Fast SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems), amorse (0,1 μM) (a se vedea tabelul suplimentar 3) și 1 μl de șablon, iar pentru fiecare probă au fost configurate două repetiții tehnice. Reacțiile qPCR au fost efectuate într-un sistem Fast Real-Time PCR 7500 (Applied Biosystems), aplicând o etapă inițială de denaturare la 95 °C timp de 20 s, urmată de 40 de cicluri de 3 s la 95 °C și 30 s la 60 °C. Curbele standard au fost utilizate pentru a determina nivelurile de expresie a genelor, iar genele housekeeping (Sp18S pentru S. purpuratus și LaRPL39 pentru L. anatina) au fost utilizate pentru normalizare.
Model de infecție bacteriană
Vibrio diazotrophicus au fost cultivate în culturi lichide de bulion marin Difco (Becton Dickinson) la 30 °C și 250 rpm peste noapte. Șase arici de mare sănătoși au fost selectați în mod aleatoriu și împărțiți în două grupuri, un grup experimental și un grup de control. S-au prelevat alicote de lichid celomic (0,5 ml) de la fiecare animal la t = 0. Aricii de mare din grupul experimental au fost injectați cu o suspensie de Vibrio diazotrophicus viu în 200 µl de apă de mare artificială sterilă, cantitatea de bacterii fiind ajustată pentru fiecare arici de mare astfel încât să corespundă la 106 celule/ml din volumul total de lichid celomic. Grupul de control a fost injectat cu 200 µl de apă de mare sterilă. La t = 6, 24 și 48 de ore, s-au prelevat 200 µl de lichid celomic de la fiecare animal din fiecare grup. ARN a fost extras din celomocitele obținute la fiecare moment, iar din probele de la t = 0 s-a preparat, de asemenea, ADN genomic. Perechile de amorsă pentru analiza expresiei genice (tabelul suplimentar 3) au fost mai întâi testate pe probele de ADN genomic pentru a se asigura că pot amplifica gena respectivă de la fiecare individ, în ciuda nivelurilor notabile de polimorfism ale secvenței lor în cadrul populației de S. purpuratus (a se vedea Fig. 1b). RT-PCR cantitativă (conform descrierii de mai sus) a fost utilizată pentru a măsura nivelurile de expresie a genelor cu cel puțin două replici tehnice pentru fiecare eșantion. Valorile de expresie au fost mai întâi normalizate la nivelurile de 18S din fiecare eșantion și apoi la valorile de la t = 0 pentru fiecare animal. S-au utilizat trei replici biologice pentru grupul experimental și grupul de control, iar toate punctele de date sunt prezentate.
Sesizări CDA cu reporter de rezistență la kanamicină
S-a utilizat un protocol optimizat al unui test utilizat pe scară largă pentru a măsura activitățile CDA polinucleotide26. Plasmidul reporter al deaminazei pTAC-Kan care conține o mutație punctiformă L94P în gena KanR și vectorii individuali de expresie pASK-SpAIDLX/LaAIDLX au fost transformați secvențial în tulpina E. coli BH156 cu deficit de UNG. Vectorul de expresie AID uman pASK-HsAID și vectorul pASK gol au servit drept controale pozitive și, respectiv, negative. Pentru testul deaminazei, cel puțin opt colonii individuale pentru fiecare deaminază putativă au fost cultivate în bulion LB (conținând 50 μg/ml de ampicilină (Amp), 50 μg/ml de spectinomicină (Spc) și 17 μg/ml de cloramfenicol (Cam)) până când densitatea optică la 600 nm a atins 0,3. Fiecare cultură a fost apoi împărțită în două. În timp ce IPTG (1 mM) a fost adăugat la ambele, anhidrotetraciclină (AHT) (0,2 μg/ml) a fost adăugat doar la una dintre ele pentru a induce expresia de SpAIDLX/LaAIDLX. După incubare timp de 3 h la 37 °C și 200 rpm, culturile au fost centrifugate, spălate cu PBS și întinse pe plăci LB care conțin fie 50 μg/ml de Amp, 50 μg/ml de Spc și 17 μg/ml de Cam, fie 50 μg/ml de Amp, 50 μg/ml de Spc, 17 μg/ml de Cam și 30 μg/ml de kanamicină (Kan). Frecvențele de reversie au fost calculate ca raport între numărul de colonii KanR și numărul total de colonii de pe placa Amp+Spc+Cam. Frecvența de reversie relativă a fost apoi determinată ca raport al frecvențelor de reversie dintr-o pereche de culturi de bacterii identice, în care transcripția KanR a fost indusă cu IPTG fie în prezența, fie în absența expresiei deaminazei. Pentru a confirma faptul că coloniile KanR au fost într-adevăr rezultatul dezaminării ADN-ului, plasmidele pTAC-Kan din mai multe colonii au fost purificate, iar reversia codonului de oprire a fost confirmată prin secvențierea ADN-ului.
Sesizări CDA utilizând rpoB ca raportor
A fost utilizat un protocol optimizat al unei testări utilizate pe scară largă pentru a măsura activitățile CDA ale polinucleotidelor35. Vectorii de expresie pASK individuali ai deaminazelor invertebrate au fost transformați separat în E. coli BH156 cu deficit de UDG. Patru ml de culturi de mediu LB conținând 100 µg/ml Amp, 17 µg/ml Cam și 0,3 µg/ml AHT au fost inoculate cu colonii bacteriene unice. Culturile au fost cultivate timp de 24 de ore la 37 °C, la 230 rpm, iar o parte din ele au fost plasate pe plăci de agar LB care conțin 100 µg/ml Amp sau 100 µg/ml rifampicină și au fost cultivate la 37 °C peste noapte. Coloniile au fost numărate, iar frecvența de reversie a fost calculată ca raport între numărul de colonii RifR și numărul de colonii AmpR din aceeași cultură. Culturile care exprimă HsAID sau care conțin vectorul de expresie pASK gol au servit drept controale pozitive și, respectiv, negative. Au fost testate cel puțin opt culturi pentru fiecare construcție de expresie. Pentru a determina identitatea mutațiilor în gena rpoB din coloniile rezistente la rifampicină, s-au efectuat PCR-uri de colonii din 24 de colonii individuale folosind polimeraza Phusion și perechea de amorsă rpoBF/rpoBR. Produsele PCR au fost purificate pe gel și au fost supuse secvențierii cu ajutorul primerului rpoBF. Mutațiile au fost identificate prin comparație cu secvența WT (Genbank acc. CP024859.1, nt 2321219-2321797).
Expresia proteică a deaminazelor invertebrate în E. coli
Pentru monitorizarea nivelului de expresie a SpAIDLX/LaAIDLX în testele de deaminază, pASK_V5-SpAIDLX/LaAIDLX au fost transformate în BH156 cu deficit de UNG. Coloniile individuale au fost cultivate în bulion LB (care conține 50 μg/ml de Amp, 50 μg/ml de Spc și 17 μg/ml de Cam) până când densitatea optică la 600 nm a fost de 0,3. În cultură s-au adăugat IPTG (1 mM) și AHT 0,2 (μg/ml) pentru a induce expresia proteinelor. După o incubare de 3 h (37 °C, 200 rpm), culturile au fost peletizate și spălate cu PBS. Peletele au fost lizate în tampon de probă SDS 2x, diluate de zece ori și separate pe o pereche de geluri SDS-PAGE 10%. În timp ce un gel a fost colorat cu albastru Coomassie pentru a evalua dacă au fost încărcate cantități egale de proteine, celălalt gel a fost transferat pe membrane PVDF prin transfer semiuscat, iar deaminazele marcate cu V5 au fost detectate cu ajutorul unui anticorp primar anti-V5 de șoarece (Abcam, ab27671) și a unui antiser secundar iepure-anti-șoarece cuplat cu peroxidază de hrean (Jackson ImmunoReasearch). Semnalele chemiluminescente au fost vizualizate cu ajutorul substratului Immobilon Western Chemiluminescent HRP (Millipore) și a unui film cu raze X sau a unui sistem de imagistică ChemiDoc Touch (BioRad). Imaginile necrozate ale tuturor gelurilor de proteine colorate și ale Western Blot-urilor sunt prezentate în figura suplimentară 5. Toate experimentele de expresie bacteriană au fost efectuate în dublu exemplar.
Bioinformatică
Comparările de secvențe cu genomul ariciului de mare au fost efectuate cu ajutorul BLAST, BLASTP sau BLASTN la https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi sau www.echinobase.org folosind fie parametrii standard, fie cu filtrul de complexitate scăzută dezactivat. Alinierile de secvențe multiple au fost realizate cu ajutorul CLUSTALW și optimizate manual pe baza caracteristicilor structurale secundare preconizate. Analizele filogenetice și de evoluție moleculară au fost efectuate cu ajutorul MEGA (versiunea 7)36.
Disponibilitatea datelor
Datele de secvență care susțin rezultatele acestui studiu au fost depuse în Genbank cu următoarele coduri de acces: SpAIDL1 (MH106904, MH106904, MH106887, MH106888, MH106889, MH106890, MH106891), SpAIDL2 (MH048921, MH048922, MH048923, MH048924, MH048925), SpAIDL3 (MH106892, MH106893, MH106894, MH106895, MH106896, MH106897), SpAIDL4a (MH106905, MH080287, MH080288, MH080289, MH080290), SpAIDL9 (KY241384, KY241385, MH106898, MH106899, MH106900, MH106901, MH106902, MH106903), LaAIDL1 (MH106906), LaAIDL2 (MH106907).