Abstract
Studii anterioare au demonstrat că aportul de colină este direct legat de obezitatea indusă de dieta bogată în grăsimi și rezistența la insulină la șoareci. Scopul acestui studiu a fost de a evalua dacă aportul de colină ar putea, de asemenea, să moduleze obezitatea și rezistența la insulină cauzate de un defect genetic. Șoareci masculi ob/ob în vârstă de opt săptămâni au fost hrăniți timp de două luni fie cu o dietă cu deficit de colină, fie cu o dietă suplimentată cu colină. A fost evaluată greutatea țesuturilor, inclusiv masa de grăsime și masa slabă. Au fost investigate, de asemenea, semnalizarea intracelulară, glucagonul și insulina din plasmă, precum și testele de toleranță la glucoză și insulină. Dieta cu deficit de colină a încetinit creșterea greutății corporale și a scăzut masa de grăsime. Deficitul de colină a scăzut, de asemenea, nivelul de glucoză plasmatică și a îmbunătățit toleranța la glucoză și insulină, deși ficatul gras a fost exacerbat. Activitatea lipolitică adipoasă crescută, scăderea glucagonului plasmatic și reducerea expresiei receptorului hepatic al glucagonului au fost, de asemenea, observate în cazul dietei cu deficit de colină. Rezultatele noastre demonstrează că o dietă deficitară în colină poate scădea masa grasă și poate îmbunătăți toleranța la glucoză la șoarecii obezi și diabetici cauzată de un defect genetic.
1. Introducere
Colina este un factor alimentar important, care este implicat în unele procese cruciale, cum ar fi biosinteza neurotransmițătorului acetilcolină și a componentei membranare majore fosfatidilcolină (PC) . PC poate fi sintetizată fie pe calea CDP-colinei, fie prin metilarea fosfatidiletanolaminei de către fosfatidiletanolamina N-metiltransferaza (PEMT). Calea PEMT este semnificativă din punct de vedere cantitativ numai în ficat . Colina este, de asemenea, un precursor esențial al neurotransmițătorului acetilcolină, care acționează prin intermediul receptorilor muscarinici și nicotinici ai acetilcolinei. În ultimii ani, a devenit evidentă o posibilă legătură între colină și obezitate/diabet . A fost propus potențialul receptorilor muscarinici ai acetilcolinei ca țintă terapeutică a obezității . Recent, am constatat că deficiența PEMT ar putea proteja șoarecii de obezitatea și rezistența la insulină induse de o dietă bogată în grăsimi. Cu toate acestea, această protecție a dispărut atunci când o doză mare de colină a fost adăugată la dieta bogată în grăsimi . Calea PEMT urmată de catabolismul PC este singura cale de biosinteză cunoscută pentru colină la mamifere . La șoarecii cu deficit de PEMT s-a constatat o scădere semnificativă a conținutului de colină în mai multe țesuturi (Li et al., date nepublicate), ceea ce oferă o legătură directă între colină și obezitatea/rezistența la insulină indusă de o dietă bogată în grăsimi. În studiul actual, am hrănit șoarecii ob/ob cu o dietă cu deficit de colină (CD) pentru a evalua dacă deficitul de colină ar putea, de asemenea, să moduleze obezitatea și rezistența la insulină de origine genetică.
2. Material și metode
2.1. Animale și dietă
Toate procedurile au fost aprobate de Comitetul instituțional pentru îngrijirea animalelor de la Universitatea din Alberta, în conformitate cu liniile directoare ale Consiliului canadian pentru îngrijirea animalelor. Șoarecii masculi ob/ob în vârstă de 8 săptămâni de la The Jackson Laboratory au fost aclimatizați timp de 1 săptămână. Au fost utilizați 5 șoareci din fiecare grup. Șoarecii au avut acces liber la diete cu deficit de colină (CD) sau suplimentate cu colină (CS) timp de 2 luni. Dieta CD (MP Biomedicals Canada, nr. de catalog 901387) conținea 20 % grăsime sub formă de untură. Dieta CS a constat din dieta CD la care s-a adăugat 0,4% (p/p) clorură de colină. Șoarecii au fost sacrificați prin anestezie cu izofluran, urmată de puncție cardiacă.
2.2. Creșterea greutății corporale, măsurarea masei slabe și a masei grase
Greutatea corporală a fost măsurată săptămânal. Masa slabă și masa de grăsime au fost analizate, la 2 luni după ce șoarecii au fost puși la dietă (premortem), cu ajutorul sistemului EchoMRI.
2.3. Testul de toleranță la glucoză și insulină
Testul de toleranță la glucoză: după un post de 12 ore, șoarecii au primit o injecție intraperitoneală (i.p.) de 0,5 g de dextroză/kg greutate corporală dizolvată în soluție salină tamponată cu fosfat sterilizată (PBS). Test de toleranță la insulină: după un post de 6 ore, șoarecii au primit o injecție i.p. de 1,0 unitate de insulină (Sigma)/kg greutate corporală în PBS. Concentrațiile de glucoză din sânge au fost măsurate cu ajutorul unui glucometru în sânul cozii înainte și la momentele indicate după injectare.
2.4. Măsurarea activității complexului mitocondrial I/II
Activitățile complexului mitocondrial I și II au fost determinate prin utilizarea proteinei mitocondriale. Pe scurt, pentru a izola proteina mitocondrială, probele au fost păstrate la gheață și omogenizate într-un tampon care conține 75 mM zaharoză, 225 mM sorbitol, 1 mM EGTA și 0,1% albumină serică bovină fără acizi grași în 10mM Tris-HCl pH 7,4. Omogenatul a fost centrifugat la 600× g timp de 15 minute, iar supernatantul rezultat a fost centrifugat în continuare timp de 20 de minute la 16.200 rpm. Proteina mitocondrială din granule a fost suspendată într-un tampon care conține 20 mM Tris și 25 mM zaharoză (pH7,4) și a fost păstrată la -80°C până la utilizare. Măsurarea activității a fost efectuată într-un spectrofotometru pentru o perioadă de 5min ca o scădere a absorbanței la 600nm datorată reducerii 2,6-diclorofenol-indofenol (DCPIP) la ubichinonă-1 în prezența fie a NADH (substrat al complexului I), fie a succinatului (substrat al complexului II) în mod corespunzător. Reacția a fost efectuată în prezența antimicinei și a cianurii de potasiu ca inhibitor al complexului III și al complexului IV. Rotenona, ca inhibitor al complexului I, a fost, de asemenea, implicată în tamponul de reacție pentru activitatea complexului II.
2.5. Histologie și imunoblotting
Pentru histologie, ficatul sau tampoanele adipoase au fost disecate în formaldehidă 10% în PBS, apoi au fost urmate de colorarea de rutină cu hematoxilină și eozină. Pentru imunoblotting, în urma omogenizării și centrifugării la 600× g a probelor de ficat, supranatantele rezultate au fost supuse determinării concentrației de proteine (BioRad) pentru a se asigura că o cantitate egală de proteine a fost încărcată pe SDS-PAGE. Toți anticorpii primari împotriva lipazei sensibile la hormoni (fosfo-HSL/total HSL), fosfoenolpiruvatul carboxikinazei, (PEPCK), acetil-CoA carboxilaza (fosfo-ACC/total ACC) și proteina kinaza activată de AMP (fosfo-AMPK/total AMPK) sunt achiziționați de la Cell Signaling. Anticorpii pentru piruvat dehidrogenază kinaza izozima 4 (PDK4), receptorul glucagonului au fost obținuți de la Abcam, dar supresorul semnalizării citokinelor 3 (SOCS3) și PGC-1α au fost de la Santa Cruz Biotechnology. tublin sau actina au fost utilizate ca și controale de încărcare pentru normalizare. Imaginea a fost analizată cu software-ul ImageJ.
2.6. Măsurarea insulinei plasmatice și a glucagonului
Măsurătorile au fost efectuate utilizând un kit de testare a glucagonului, insulinei la șoarece/raton (Meso Scale Discovery) pe baza instrucțiunilor companiei.
2.7. Analiză statistică
Datele sunt prezentate ca medie ± SD. Diferențele au fost evaluate cu ajutorul testului t al lui Student. O valoare de 𝑃<0,05 a fost considerată semnificativă.
3. Rezultate
Dieta cu deficit de colină a încetinit semnificativ creșterea greutății corporale până la 2 luni (Figura 1(a)) fără a influența consumul de hrană (aportul zilnic de hrană 7,21±1,23 g pentru șoarecii CD față de 7,39±1,31 g pentru șoarecii CS, 𝑃>0,05). A existat o diferență semnificativă în ceea ce privește greutatea corporală inițială între cele două grupuri (30,42±1,70 g pentru șoarecii CD față de 26,3±2,26 g pentru șoarecii CS, 𝑃=0,01). Deficitul de colină nu a influențat greutatea inimii, a ficatului sau a rinichilor [Figura 1(b)], dar a existat o scădere semnificativă a greutății grăsimii epididimale și perirenale [Figura 1(c)]. O analiză suplimentară, folosind imagistica prin rezonanță magnetică, a arătat că deficitul de colină a scăzut masa de grăsime din întregul corp și a crescut totuși masa slabă, indiferent dacă este exprimată ca masă absolută sau ca procent relativ la masa întregului corp [Figura 1(d)]. Deficitul de colină a crescut expresia lipazei sensibile la fosfohormoni din țesutul adipos, o formă activată a enzimei [figura 1(e)]. Pe de altă parte, deficitul de colină nu a modificat morfologia țesutului adipos [figura 1(f)].
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
Colină-dieta deficitară atenuează creșterea în greutate corporală și sporește capacitatea lipolitică adipoasă. Șoarecii masculi ob/ob în vârstă de 8 săptămâni au avut acces liber la dietele CD sau CS timp de 2 luni. S-a măsurat creșterea în greutate corporală (a), greutatea țesutului (b), greutatea grăsimii epididimale și perirenale (c), precum și masa de grăsime și masa slabă (d). Expresia proteică a fosfo- și totalului de lipază sensibilă la hormoni în țesutul adipos a fost analizată prin imunoblotting (e). Secțiunile plăcuțelor adipoase au fost colorate cu H & E (f). ∗∗∗𝑃<0,01 și ∗𝑃<0,05 în comparație cu grupul CS.
Pe lângă faptul că a influențat greutatea corporală, deficitul de colină a scăzut, de asemenea, glucoza plasmatică la post (14,3±1,67 față de 10,8±1,19, 𝑛=5, 𝑃<0,05) și nivelul de glucagon (Figura 2(a)), deși nu a avut niciun efect asupra nivelului de insulină plasmatică (Figura 2(b)). S-a observat o ameliorare semnificativă a intoleranței la glucoză și la insulină la șoarecii cu regim alimentar deficitar în colină (figurile 2(c)-2(d)). Pentru a investiga mecanismul de bază, au fost analizate enzimele-cheie pentru oxidarea glucozei. Deficitul de colină a redus expresia proteică hepatică a PDK4 [figura 3(a)], un regulator negativ al activității piruvatului dehidrogenazei care controlează afluxul de acetil-CoA mitocondrial, ceea ce indică o utilizare îmbunătățită a glucozei. În mod similar, PGC-1α hepatică (un binecunoscut modulator în amonte al PDK4) și PEPCK (o țintă în aval a PGC-1 α și o enzimă cheie pentru gluconeogeneză) au fost reduse (Figura 3(b)), sugerând o gluconeogeneză diminuată. Mai mult, am investigat dacă îmbunătățirea intoleranței la glucoză și insulină ar putea fi asociată cu modificarea inflamației hepatice și a funcției mitocondriale. Nu a fost afectată nici expresia proteică a SOCS3 [Figura 3(c)], un marker al proinflamării, nici activitatea citrat-sintetazei mitocondriale (datele nu sunt prezentate). Cu toate acestea, activitatea complexului mitocondrial II, dar nu și a complexului I, a fost semnificativ diminuată de deficitul de colină [Figura 3(d)]. Este interesant faptul că expresia proteică a receptorului hepatic al glucagonului a fost, de asemenea, diminuată de deficitul de colină [Figura 3(e)].
(a)
(b)
(c)
(d)
.
(a)
(b)
(c)
(d)
Colină-dieta deficitară îmbunătățește intoleranța la glucoză și insulină. Șoarecii masculi ob/ob în vârstă de 8 săptămâni au avut acces liber la dietele CD sau CS timp de 2 luni. S-a măsurat nivelul glucagonului plasmatic la jeun (a) și al insulinei (b). Au fost efectuate testul intraperitoneal de toleranță la glucoză (c) și testul de toleranță la insulină (d). ∗∗∗𝑃<0,01 și ∗𝑃<0,05 în comparație cu grupul CS.
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
Mecanismele moleculare implicate în îmbunătățirea sensibilității la insulină la șoarecii ob/ob cu colină.cu regim alimentar deficitar. Șoarecii ob/ob masculi în vârstă de 8 săptămâni au avut acces liber la dietele CD sau CS timp de 2 luni. Expresia proteică hepatică a PDK4 (a), PEPCK, PGC-1α (b), SOCS3 (c) și a receptorului de glucagon (e) a fost analizată prin imunoblotting. Activitățile complexului mitocondrial I și II au fost, de asemenea, măsurate (d). ∗𝑃<0,05 în comparație cu grupul CS.
Chiar dacă îmbunătățește toleranța la glucoză, deficiența de colină exacerbează ficatul gras, susținută de analiza histologică și de creșterea masei de trigliceride hepatice [Figura 4(a)]. Pentru a înțelege mecanismele care stau la baza ficatului gras indus de deficitul de colină, am analizat enzimele implicate în β-oxidarea acizilor grași și în lipogeneză. Deficitul de colină a crescut activitatea glicerol-3-fosfo-acetiltransferazei hepatice (GPAT) [Figura 4(b)] și a scăzut activitatea β-hidroxiacil-CoA dehidrogenazei (β-HAD) [Figura 4(c)], o enzimă-cheie a β-oxidării acizilor grași, ceea ce indică faptul că mai mulți acizi grași intracelulari au fost canalizați în biosinteza lipidelor, mai degrabă decât în oxidare. Această noțiune a fost susținută și mai mult de o scădere a expresiei hepatice phospho-AMPK și phospho-ACC (Figura 4(d)), care apoi activează ACC și sporește lipogeneza hepatică.
(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d)
Mecanismele moleculare implicate în dezvoltarea ficatului gras la șoarecii ob/ob cu colină-dietă deficitară. Șoarecii ob/ob masculi în vârstă de 8 săptămâni au avut acces liber la dietele CD sau CS timp de 2 luni. Secțiunile de ficat au fost colorate cu protocolul de colorare H & E, iar cantitatea de trigliceride hepatice a fost măsurată (a). Au fost analizate activitățile glicerol-3-fosfat-aciltransferazei (GPAT) (b) și β-hidroxil acil-CoA dehidrogenazei (β-HAD) (c). A fost monitorizată expresia proteică a fosfo-AMPK și fosfo-ACC (d). ∗𝑃<0,05 în comparație cu grupul CS.
4. Discuții
În lucrările anterioare, am demonstrat că suplimentarea colinei este legată de obezitatea indusă de dieta bogată în grăsimi și rezistența la insulină la șoarecii cu deficit de PEMT . Recent, am constatat că rezistența la insulină indusă de colină este specifică colinei, nu numai la șoarecii de tip sălbatic, ci și la șoarecii cu deficit de PEMT (Wu și Vance et al. date nepublicate). În studiul actual, am investigat impactul privării de colină asupra șoarecilor ob/ob. Am demonstrat cinci efecte noi ale deficienței de colină: (1) creșterea activității lipolitice adipoase; (2) îmbunătățirea oxidării glucozei; (3) scăderea oxidării hepatice a acizilor grași; (4) reducerea expresiei receptorului hepatic al glucagonului; (5) reducerea activității complexului II mitocondrial hepatic.
4.1. Deficitul de colină atenuează creșterea în greutate corporală
Deficitul de colină atenuează semnificativ obezitatea indusă de dieta bogată în grăsimi la șoarecii Pemt-//- și creșterea în greutate la șoarecii ob/ob. Cu toate acestea, Raubenheimer și colab. au raportat că deficitul de colină nu a afectat creșterea în greutate sau greutatea țesutului adipos . Diferența dintre cele două studii s-ar putea datora diferențelor dintre modelele de animale și protocoalele de hrănire. În studiul lui Raubenheimer, șoarecii C57Bl/6 au fost hrăniți fie cu o dietă bogată în grăsimi, fie cu o dietă săracă în grăsimi timp de 8 săptămâni, dar șoarecii au primit doar dieta CD sau CS în ultimele 4 săptămâni. Șoarecii noștri ob/ob au fost hrăniți cu dieta cu conținut ridicat de grăsimi CD sau CS timp de 8 săptămâni. În literatura de specialitate, atât șoarecii ob/ob masculi, cât și femele, au fost utilizați pe scară largă în studii metabolice, cum ar fi creșterea în greutate corporală și sensibilitatea hepatică (și musculară) la insulină, și nu a fost raportat niciun efect semnificativ de gen. În studiul nostru, au fost utilizați numai șoareci ob/ob masculi.
Studiul nostru actual demonstrează că colina poate, de asemenea, să moduleze obezitatea de origine genetică. Deoarece deficitul de colină nu a influențat consumul de alimente, activitatea lipolitică adipoasă crescută (expresia îmbunătățită a lipazei active sensibile la hormoni) poate explica reducerea masei de grăsime și creșterea în greutate corporală. În plus, nu putem exclude posibilitatea ca deficitul de colină să sporească cheltuielile energetice sau expresia UCP1 în țesutul adipos brun și a UCP2/UCP3 în mușchiul scheletic, care sunt factori potențiali care contribuie la scăderea creșterii în greutate corporală .
4.2. Deficitul de colină îmbunătățește toleranța la glucoză
În contrast cu suplimentarea cu colină, care este legată de rezistența la insulină indusă de o dietă bogată în grăsimi la șoareci , deficitul de colină a îmbunătățit toleranța la glucoză la șoarecii ob/ob. Acest lucru este în concordanță cu studiul lui Raubenheimer, unde șoarecii C57Bl/6 cu o dietă bogată în grăsimi CD au avut niveluri scăzute de insulină și toleranță la glucoză îmbunătățită în comparație cu dieta bogată în grăsimi suplimentată cu colină . Un nivel ridicat de glucagon în plasmă se găsește de obicei la pacienții diabetici de tip 2 . Injecția de colină a crescut atât nivelul de insulină plasmatică, cât și cel de glucagon la șobolani. Dimpotrivă, în studiul nostru, deficitul de colină a scăzut nivelul plasmatic al glucagonului și a scăzut expresia receptorului de glucagon. Având în vedere că în ultimii ani, antagoniștii receptorilor de glucagon au fost propuși ca potențiale medicamente terapeutice pentru diabetul de tip 2, scăderea expresiei proteice a receptorului de glucagon la șoarecii ob/ob cu o dietă cu deficit de colină poate explica, într-o anumită măsură, toleranța îmbunătățită la glucoză. Scăderea expresiei hepatice a PGC-1α a fost concomitentă cu o reducere a PEPCK și PDK4, indicând o scădere a producției de glucoză și o creștere a oxidării glucozei. Reglarea descendentă a activității β-HADH a sugerat o scădere a oxidării acizilor grași. Aceste procese au fost însoțite de o diminuare a activității complexului mitocondrial II, care poate reflecta un răspuns compensatoriu la reducerea stresului oxidativ mitocondrial. Astfel, toleranța la glucoză îmbunătățită de CD s-a datorat scăderii producției hepatice de glucoză și creșterii utilizării glucozei. Acest lucru ar putea avea loc prin suprimarea receptorului hepatic al glucagonului, care reglează AMPK prin intermediul adenilatciclazei, modulând astfel PGC-1α și țintele sale din aval, cum ar fi PEPCK și PDK4, precum și capacitatea de transport de electroni mitocondrială hepatică. Astfel, sunt necesare investigații suplimentare pentru a dovedi dacă receptorul glucagonului ar putea fi o nouă țintă terapeutică pentru diabet.
4.3. Deconectarea dintre ficatul gras și rezistența la insulină
Fătul gras s-a dovedit a fi un predictor independent de obezitate al diabetului de tip 2. Se crede că acizii grași intracelulari crescuți joacă un rol cauzal în rezistența hepatică la insulină . În studiul actual, deficitul de colină a exacerbat ficatul gras, în care s-a observat o scădere a activității β-hidroxiactil CoA dehidrogenazei și o creștere a activității glicerol palmitoil-acil transferazei, sugerând un rol al colinei în modularea metabolismului acizilor grași. Prin urmare, redirecționarea acizilor grași către depozitul hepatic de trigliceride poate fi un mecanism inițial de protecție pentru a reduce concentrațiile intracelulare hepatice de acizi grași. Cu toate acestea, deficitul de colină pe termen lung este legat de hepatosteatoză, de riscul de defect de tub neural, precum și de riscul de cancer și de pierdere a memoriei , ceea ce poate limita utilizarea unei diete cu deficit de colină ca strategie terapeutică pe termen lung pentru obezitate și rezistență la insulină.
În concluzie, deficitul de colină poate preveni creșterea în greutate corporală și poate îmbunătăți toleranța la glucoză la șoarecii ob/ob. O restricție modestă a consumului de alimente cu conținut ridicat de colină poate fi benefică pentru pacienții obezi, prediabetici și diabetici. Rezultatele noastre sugerează noi abordări terapeutice posibile.
Abbreviații
| PC: | Fosfatidilcolină |
| PEMT: | Fosfatidiletanolamină N-metiltransferază |
| CD: | Deficit de colină |
| CS: | Supliment de colină |
| HSL: | Lipază sensibilă la hormoni |
| PEPCK: | Fosfoenolpiruvat carboxikinaza |
| ACC: | Acetil-CoA carboxilaza |
| AMPK: | Proteina kinaza activată de AMPK (AMPK) |
| PDK4: | Iozima 4 a piruvat dehidrogenază kinazei 4 |
| SOCS3: | Supresor al semnalizării citokinelor 3 |
| GPAT: | Glicerol-3-fosfo-acetiltransferaza. |
Contribuția autorilor
G. Wu și L. Zhang au contribuit în mod egal.
Dezvăluirea autorilor
Autorii declară că nu există conflicte de interese.
Recunoștințe
Această lucrare a fost susținută de un grant (MOP 89793) de la Canadian Institutes of Health Research.
.