Metoda Sanger este utilizată pentru a amplifica un segment țintă de ADN, astfel încât secvența de ADN să poată fi determinată cu precizie. Încorporarea ddNTP-urilor în supapele de reacție sunt folosite pur și simplu pentru a termina sinteza unui lanț de ADN în creștere, rezultând fragmente de ADN parțial replicate. Acest lucru se datorează faptului că ADN polimeraza are nevoie de gruparea OH 3′ a lanțului în creștere și de gruparea fosfat 5′ a dNTP-ului care intră pentru a crea o legătură fosfodiester. Uneori, ADN-polimeraza va încorpora un ddNTP, iar absența grupării 3′ OH va întrerupe reacția de condensare dintre fosfatul 5′ (în urma scindării pirofosfatului) al nucleotidului nou intrat și gruparea hidroxil 3′ a nucleotidului anterior de pe lanțul în creștere. Această reacție de condensare ar avea loc în mod normal la încorporarea unui dNTP nemodificat de către ADN polimeraza. În termenii cei mai simpli, atacul nucleofilic al grupului 3′ OH duce la adăugarea unui nucleotid pe un lanț în creștere. Absența grupului hidroxil 3′ inhibă acest atac nucleofilic, împiedicând capacitatea ADN polimerazelor de a-și continua funcția.
Această descoperire a dus la denumirea sa adecvată de „nucleotide de terminare a lanțului”. Dideoxiribonucleotidele nu au o grupare hidroxil 3′, prin urmare nu mai poate avea loc nicio alungire a lanțului odată ce această dideoxinucleotidă se află pe lanț. Acest lucru poate duce la terminarea secvenței de ADN. Astfel, aceste molecule stau la baza metodei de terminare a lanțului dideoxi de secvențiere a ADN-ului, care a fost raportată de Frederick Sanger și echipa sa în 1977 ca o extindere a lucrărilor anterioare. Abordarea lui Sanger a fost descrisă în 2001 ca fiind una dintre cele două metode fundamentale de secvențiere a fragmentelor de ADN (cealaltă fiind metoda Maxam-Gilbert), dar metoda Sanger este atât „cea mai utilizată pe scară largă, cât și metoda folosită de majoritatea secvențiatoarelor automate de ADN”. Sanger a primit cel de-al doilea Premiu Nobel pentru Chimie în 1980, pe care l-a împărțit cu Walter Gilbert („pentru contribuțiile lor privind determinarea secvențelor de baze din acizii nucleici”) și cu Paul Berg („pentru studiile sale fundamentale privind biochimia acizilor nucleici, în special în ceea ce privește ADN-ul recombinat”), și a discutat despre utilizarea dideoxinucleotidelor în prelegerea sa Nobel.
Secvențierea ADN-uluiEdit
Dideoxinucleotidele sunt utile în secvențierea ADN-ului în combinație cu electroforeza. O probă de ADN care este supusă PCR (reacție în lanț a polimerazei) într-un amestec care conține toate cele patru deoxinucleotide și o dideoxinucleotidă va produce șiruri de lungime egală cu poziția fiecărei baze din tipul care completează tipul care are prezentă o dideoxinucleotidă. Taq polimeraza utilizată în PCR favorizează ddGNTP, acesta fiind un model observat în diverse cercetări. Adică, fiecare bază nucleotidică din tipul respectiv are o probabilitate de a fi legată nu de o deoxinucleotidă, ci mai degrabă de o dideoxinucleotidă, ceea ce încheie alungirea lanțului. Prin urmare, dacă proba este apoi supusă electroforezei, va fi prezentă o bandă pentru fiecare lungime la care este prezent complementul dideoxinucleotidei. În prezent, se obișnuiește să se utilizeze dideoxinucleotide fluorescente, astfel încât fiecare dintre cele patru are o fluorescență diferită care poate fi detectată de un secvențiator; astfel, este necesară o singură reacție.
.