Sanes și Lichtman au folosit injecția pronucleară pentru a insera aceste construcții Brainbow în șoareci. Când au imaginat creierele de șoareci, au găsit mult mai mult de 3-4 culori datorită integrării în tandem a mai multor copii ale construcției (aproximativ 8 la șoarecii Brainbow-1.0.) Efectul combinatoriu al evenimentelor de recombinare multiple și independente duce la un curcubeu de culori. Cu trei copii ale construcției, ne-am aștepta la zece culori (a se vedea tabelul din dreapta); în diverse rapoarte, Sanes și Lichtman au observat între 90-160 de culori distincte datorită unui număr mai mare de copii. Numele Brainbow este cu adevărat potrivit pentru această tehnologie colorată.
Optimizarea sistemului: Brainbow-3
Deși Brainbow a oferit neuroștiințelor o gamă vastă de culori necesare pentru a marca neuronii individuali, sistemul a suferit, de asemenea, de o serie de limitări. În primul rând, imagistica țesutului de șoarece Brainbow a fost o provocare din cauza intensității scăzute a fluorescenței, cauzată parțial de fotoinstabilitatea fluoroforilor, precum și de tendința fluoroforilor de a se agrega în somatele neuronilor. În al doilea rând, sistemul nu a permis analiza prin imunomarcație. Deși fluoroforii utilizați sunt diferiți din punct de vedere al fluorescenței, secvențele proteice ale acestora sunt foarte omoloage, împiedicând proiectarea de anticorpi specifici pentru fiecare fluorofor. În al treilea rând, Brainbow-1 și Brainbow-2 conțineau fiecare o stare „implicită”; de exemplu, Brainbow-1.0 exprimă RFP atunci când construcția nu a suferit o recombinare. Această stare implicită a fost exprimată în mod disproporționat de majoritatea neuronilor, limitând numărul de culori distincte care puteau fi observate într-o anumită zonă.
În 2013, Dawen Cai, et al. au lansat un rafinament al tehnologiei Brainbow, Brainbow-3.0, cu scopul de a depăși limitările enumerate mai sus. În primul rând, aceștia au analizat o varietate de proteine fluorescente pentru a le găsi pe cele cu caracteristici ideale (agregare scăzută, fotostabilitate ridicată și stabilitate ridicată după fixare.) Din cele șapte proteine rezultate, au ales trei cu niveluri scăzute atât de fluorescență, cât și de suprapunere a secvențelor (coral mOrange2, meduză EGFP și anemonă de mare mKate2.) Apoi au generat cu succes anticorpi personalizați pentru fiecare dintre aceste proteine și au confirmat că nu există reactivitate încrucișată, deschizând ușa pentru analiza de imunomarcație. Pentru a obține o etichetare celulară uniformă, ei au generat derivați farnesilați ai proteinelor fluorescente, care sunt traficate direct în membranele celulare. Traficul membranar al derivaților farnesilați permite marcarea proceselor axonale și dendritice delicate, care nu erau vizibile anterior cu Brainbow-1 și -2.
Structura generală a Brainbow-1.0 este păstrată în Brainbow-3.0, dar cu mOrange2, EGFP și mKate2 ca fluorofori; mOrange2 este starea implicită. În schimb, Brainbow-3.1 și -3.2 nu prezintă fluorescența implicită din cauza adăugării casetei STOP care blochează traducerea imediat după promotor. Caseta STOP include o YFP mutantă care nu este fluorescentă, dar care poate fi detectată prin imunomarcație. Această caracteristică facilitează depistarea șoarecilor Brainbow Cre-negativi pentru a determina numărul și tipul de celule în care este exprimată construcția. Fotostabilitatea Brainbow-3.2 este îmbunătățită datorită adăugării unui element de reglare post-transcripțională a virusului hepatitei Woodchuck (WPRE), utilizat în mod obișnuit pentru a crește nivelul proteinelor transgenice.
Variante Brainbow și aplicații dincolo de creierul de șoarece
În plus față de îmbunătățirea sistemului Brainbow, Sanes și Lichtman au dezvoltat, de asemenea, o construcție Flpbow complementară care este similară din punct de vedere funcțional cu Brainbow bazat pe Cre, dar este controlată de recombinaza FLP/FRT. Atunci când sunt plasate sub promotori diferiți, Brainbow și Flpbow pot fi utilizate pentru a marca populații celulare distincte.
Pentru a reduce numărul de animale necesare pentru a produce animale cu transgene Brainbow și Cre, Cai și colab. au creat, de asemenea, o construcție Autobow care conține atât Cre, cât și XFP. Producția Cre conduce recombinarea și selecția XFP, urmată de autoexcizia Cre. Aceste construcții sunt menținute în mod stabil timp de cel puțin șase generații.
În plus față de construcțiile neuronale pThy1-Brainbow, Addgene are, de asemenea, doi vectori virali adeno-asociați Brainbow (AAV) disponibili – AAV-EF1a-BbChT și AAV-EF1a-BbTagBY. Aceste construcții conțin două XFP-uri fiecare, din cauza limitărilor de dimensiune asociate cu AAV; coinfectarea cu ambele construcții produce un minim de 8 culori. Utilizarea AAV asigură un control spațial și temporal fără a fi necesară modificarea liniei germinale și permite utilizarea Brainbow la o varietate de specii.
Mai multe variante au fost create de alte laboratoare, inclusiv R26R-Confetti descrisă în Hugo J. Snippert, et al. (2010) și strategia MAGIC Marker descrisă în Karine Loulier, et al. (2014).
În prezent, tehnicile Brainbow sunt, de asemenea, aplicate pentru a studia organisme model, cum ar fi Drosophila și peștele zebră. Brainbow la Drosophila a ajutat la cartografierea circuitelor neuronale, cum ar fi conexiunile dintre neuronii motori și joncțiunea neuromusculară. La peștele zebră, metoda a devenit foarte utilă în urmărirea liniei de descendență; „Zebrabow” a fost folosit pentru a urmări dezvoltarea epiteliului cornean.
Pentru oamenii de știință interesați de neuroștiință și dezvoltare, Brainbow este un instrument valoros pentru a marca și urmări celule individuale datorită gamei largi și a stabilității ridicate a culorilor. Sanes și Lichtman estimează că etichetarea colorată a Brainbow a redus timpul de cartografiere pentru o anumită secțiune de creier cu cel puțin un ordin de mărime. Este clar că perfecționările ulterioare ale tehnicii Brainbow vor oferi informații importante despre organizarea fizică complicată a creierului și a altor sisteme biologice.
Vă interesează să aplicați Brainbow în cercetarea dumneavoastră? Consultați plasmidele Brainbow disponibile la Addgene!
Căutați plasmidele Brainbow @Addgene:
- Brainbow 1.0, 1.1, 2.1 plasmide
- Brainbow 3.0, 3.1, 3.2 plasmide
Strategii transgenice pentru exprimarea combinatorie a proteinelor fluorescente în sistemul nervos. Livet J, Weissman TA, Kang H, Draft RW, Bennis RA, Sanes JR, Lichtman JW. Nature. 2007 Nov 1;450(7166):56-62. PubMed.
A technicolor approach to the connectome. Lichtman JW, Livet J, Sanes JR. Nature Reviews Neuroscience. 2008 Jun;9(6):417-22. doi: 10.1038/nrn2391. Epub 2008 Apr 30. PubMed.
Homeostazia criptelor intestinale rezultă din competiția neutră între celulele stem Lgr5 care se divid simetric. Snippert HJ, van der Flier LG, Sato T, van Es JH, van den Born M, Kroon-Veenboer C, Barker N, Klein AM, van Rheenen J, Simons BD, Clevers H. Cell. 2010 Oct 1;143(1):134-44. PubMed.
Drosophila Brainbow: o tehnică de etichetare a fluorescenței bazată pe recombinază pentru a subdiviza modelele de expresie neuronală. Hampel S, Chung P, McKellar CE, Hall D, Looger LL, Simpson JH. Nature Methods. 2011 Mar;8(3):253-9. doi: 10.1038/nmeth.1566. Epub 2011 Feb 6. PubMed.
Flybow: etichetare genetică multicoloră a celulelor pentru analiza circuitelor neuronale la Drosophila melanogaster. Hadjieconomou D, Rotkopf S, Alexandre C, Bell DM, Dickson BJ, Salecker I. Nature Methods. 2011 Mar;8(3):260-6. doi: 10.1038/nmeth.1567. Epub 2011 Feb 6. PubMed.
Improved tools for the Brainbow toolbox. Cai D, Cohen KB, Luo T, Luo T, Lichtman JW, Sanes JR. Nature Methods. 2013 May 5:10(6):540-7. doi: 10.1038/nmeth.2450. Epub 2013 mai 5. PubMed.
Zebrabow: etichetare celulară multispectrală pentru urmărirea celulelor și analiza liniei la peștele zebră. Pan YA, Freundlich T, Weissman TA, Schoppik D, Wang XC, Zimmerman S, Ciruna B, Sanes JR, Luchtman JW, Schier AF. Dezvoltare. 2013 Jul;140(13):2835-46. doi: 10.1242/dev.094631. PubMed.
Multiplex cell and lineage tracking with combinatorial labels. Loulier K, Barry R, Mahou P, Le Franc Y, Supatto W, Matho KS, Ieng S, Fouquet S, Dupin E, Benosman R, Chédotal A, Beaurepaire E, Morin X, Livet J. Neuron. 2014 Feb 5;81(3):505-20. PubMed.
.