Abstract
Danggui Buxue Tang (DBT), un decoct din plante care conține Astragali Radix (AR) și Angelicae Sinensis Radix (ASR), a fost utilizat în tratarea neregulilor de menopauză la femei de peste 800 de ani în China. Rezultatele farmacologice au arătat că DBT a prezentat proprietăți estrogenice semnificative in vitro, ceea ce a sugerat, prin urmare, că DBT ar putea activa receptorii nucleari de estrogen. Aici, am evaluat proprietățile estrogenice ale DBT într-un model de șobolan ovariectomizat in vivo: DBT a fost aplicat la șobolanii ovariectomizați timp de 3 zile. Aplicarea DBT nu a modificat greutatea uterului și a ficatului, precum și expresia transcripției markerilor de proliferare, inclusiv a receptorilor de estrogen α și β. Cu toate acestea, DBT a stimulat expresia transcripției genelor sensibile la estrogeni. În plus, a fost confirmat rolul inductiv al DBT asupra expresiei membrilor familiei de receptori de hidrocarburi arilice în uterul și ficatul șobolanilor ovariectomizați. Cu toate acestea, aceste răspunsuri ale DBT au fost clar distincte de modelul de răspuns detectabil aici pentru 17β-estradiol. Prin urmare, DBT a prezentat proprietăți estrogenice slabe, dar semnificative, in vivo; cu toate acestea, unele dintre activitățile sale au fost independente de receptorul de estrogen. Astfel, DBT ar putea fi un decoct din plante chinezești interesant pentru un tratament alternativ al terapiei de substituție hormonală pentru femeile aflate la menopauză, fără efecte secundare estrogenice ulterioare.
1. Introducere
Medicamentele tradiționale chinezești (TCM) au fost utilizate ca medicamente sau suplimente alimentare pentru sănătate în China de peste o mie de ani. Din punct de vedere istoric, TCM-urile sunt preparate sub formă de decoctări printr-o metodologie unică, cu combinații specifice de diferite plante ca o formulă. Printre mii de formule pe bază de plante, Danggui Buxue Tang (DBT) este un decoct simplu pe bază de plante care este compus din două plante. DBT a fost descris pentru prima dată în Neiwaishang Bianhuo Lun de Li Dongyuan, în China, în anul 1247 d.Hr. Li a descris că formula DBT trebuie să includă 10 qian de Astragali Radix (AR), rădăcini de Astragalus membranaceus (Fisch.) Bunge sau Astragalus membranaceus (Fisch.) Bungevar. mongholicus (Bunge) P.K. Hsiao, și doi qian de Angelicae Sinensis Radix (ASR), rădăcini de Angelica sinensis (Oliv.) Diels. Un qian echivalează cu aproximativ 3 grame. DBT este prescris femeilor din China ca remediu pentru simptomele menopauzei, care le îmbunătățește sănătatea prin creșterea „Qi” (energia vitală) și hrănirea „sângelui” (circulația corpului).
Femeile aflate la menopauză suferă de bufeuri, transpirații, anxietate și schimbări de dispoziție, precum și de un risc crescut pentru numeroase probleme de sănătate, cum ar fi pierderea masei de densitate osoasă (osteoporoză) și boli cardiovasculare. Aceste probleme se datorează în mare parte deficienței hormonilor ovarieni, în special a estrogenilor . Terapia de substituție hormonală (HRT) a fost utilizată pentru a atenua simptomele menopauzei timp de mulți ani, dar acest tratament a fost asociat cu efecte secundare, adică un risc crescut de cancer de sân, atacuri de cord și accidente vasculare cerebrale . Având în vedere aceste riscuri clinice, au fost depuse eforturi considerabile pentru a căuta sau a dezvolta noi medicamente care să aducă beneficiile terapiei hormonale, dar cu riscuri minime . MTC, care conține mii de plante medicinale, este o resursă promițătoare care ar putea oferi o soluție perfectă . Într-adevăr, unele dintre produsele pe bază de plante au demonstrat o eficacitate pronunțată pentru simptomele menopauzei și, ca urmare, au fost utilizate pe scară largă de către femei pentru ameliorarea simptomelor menopauzei, de exemplu, DBT . Experimentele in vitro cu celule derivate din glandele mamare și osoase au sugerat că cel puțin o parte din eficacitatea DBT este mediată prin mecanisme dependente de receptorul de estrogen (ER-). Pentru a susține aceste observații in vivo, DBT a fost testat la modelul de șobolan Wistar ovariectomizat pentru a determina potențialele proprietăți estrogenice. Deoarece DBT este un decoct care se consumă în mod tradițional sub formă de ceai, animalele au fost suplimentate cu DBT prin intermediul apei de băut. Pornind de la această abordare, am efectuat un test uterotrofic de trei zile pentru dezvăluirea unor răspunsuri relevante pentru a contribui la elucidarea mecanismelor moleculare de acțiune ale DBT, inclusiv greutatea organelor și reglarea expresiei genice.
2. Materiale și metode
2.1. Materiale vegetale și prepararea DBT
Ar de 3 ani derivat din rădăcinile de A. membranaceus var. mongholicus a fost colectat din provincia Shanxi , iar ASR de 2 ani de A. sinensis a fost din Minxian în provincia Gansu . Aceste materiale vegetale au fost autentificate din punct de vedere morfologic de către Dr. Tina Dong, în timpul colectării pe teren. Bonurile corespunzătoare sub formă de plante întregi, bonul nr. 02-9-1 pentru ASR și bonul nr. 02-10-4 pentru AR, au fost depuse la Centrul de Medicină Chineză, Universitatea de Știință și Tehnologie din Hong Kong. 17β-Estradiolul (E2) a fost obținut de la Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germania). 250 g de AR feliat și 50 g de ASR feliat au fost amestecate (raportul este de 5 : 1) și apoi fierte în 2.400 ml (w : v = 1 : 8) de apă timp de 2 ore, iar apoi decoctul a fost filtrat. Reziduurile au fost fierte în 1.800 mL (w : v = 1 : 6) de apă timp de 1 oră. Extractele combinate au fost uscate în vid și depozitate la -20°C. Această extracție, în urma preparatului antic, s-a dovedit a fi cea mai bună condiție de extracție . Pentru standardizarea proprietății chimice a DBT au fost utilizați doi markeri chimici din AR (calycosin și formononetin) și alți doi din ASR (acidul ferulic și ligustilida). DBT standardizat trebuie să conțină nu mai puțin de 0,186 mg de calycosină, 0,155 mg de formononetină, 0,351 mg de acid ferulic și 0,204 mg de ligustilidă la un gram de greutate uscată de DBT, așa cum s-a raportat anterior .
2.2. Animale
Șobolani Wistar femele tinere ( g) au fost obținuți de la Harlan Winkelmann (Borchen, Germania) și au fost menținuți în condiții controlate de temperatură (20°C ± 1, umiditate relativă 50-80%) și iluminare (12 ore lumină, 12 ore întuneric). Toți șobolanii au avut acces liber la dieta standard pentru șobolani (SSniff R10-Diet, SSniff GmbH, Soest, Germania) și la apă. Toate condițiile de creștere și manipulare a animalelor au fost în conformitate cu liniile directoare ale Comitetului instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor din Germania.
2.3. Testul uterotrofic
Estrogenicitatea a fost testată în testul de 3 zile la șobolani ovariectomizați în conformitate cu ghidul OCDE 440 . Procedurile experimentale sunt rezumate schematic în figura 1. Pe scurt, după ovariectomie și 14 zile de scădere hormonală endogenă, animalele au fost tratate timp de 3 zile. Animalele au fost repartizate în mod aleatoriu în grupurile de tratament cu extracte din plante, control pozitiv sau vehicul (). DBT a fost administrat pe cale orală în doze de 0,01 g/kg BW/d sau 1 g/kg BW/d BW și E2 (1 μg/kg BW/d; injecție subcutanată), care a servit drept control pozitiv. Animalele au fost sacrificate prin decapitare după o anestezie ușoară cu inhalare de CO2. Au fost determinate greutățile umede ale uterului și ale ficatului. Uterul și ficatul au fost congelate în azot lichid pentru prepararea ARN-ului.
Design experimental. Figura sintetizează designul experimental al studiului. Aceasta prezintă schematic fluxul de lucru, precum și rezumatul grupurilor de tratament incluse. bw: greutate corporală; DBT: Danggui Buxue Tang; DBT01 și DBT1: DBT la 0,01 și 1 g/kg greutate corporală/d.
2.4. Prepararea ARN-ului total și transcrierea inversă
ARN-ul citoplasmatic total a fost extras din uteri de șobolan prin metoda standard TRIzol (Invitrogen, Grand Island, NY). Reziduurile de ADN au fost eliminate enzimatic prin digestie (Deoxyribonuclease I, Ambion, Foster City, CA), iar eliminarea a fost verificată prin PCR. Transcriptaza inversă Superscript II (Invitrogen) și Oligo (dT) 12-18 au fost utilizate pentru sinteza ADNc de tip first-strand.
2.5. PCR cantitativă în timp real
PCR cantitativă în timp real a fost efectuată cu ajutorul ADN polimerazei Platinum Taq (Invitrogen) folosind termociclatorul iCycler cu sistem de detecție în timp real iQ. Reacțiile au fost rulate de trei ori în triplu exemplar. După vortexare, s-au pipetat alicote de 50 μL din amestec în fiecare gode al plăcii PCR cu pereți subțiri de 96 de godeuri (Bio-Rad, Hercules, CA). Reacțiile PCR au constat într-un prim ciclu de denaturare la 95 °C timp de 3 minute, urmat de 50 de cicluri de 10 s la 95 °C, 15 s la 60 °C și 30 s la 72 °C. Fluorescența a fost cuantificată la sfârșitul etapei de recoacere la 60°C, iar identitatea produsului a fost confirmată prin analiza curbei de topire (60-95°C). Secvențele primerilor și dimensiunile ampliconului sunt rezumate în tabelul suplimentar 1 din materialul suplimentar disponibil online la http://dx.doi.org/10.1155/2014/438531. Cantitățile relative de ARNm ale genelor țintă au fost calculate după normalizarea la o genă de referință endogenă (subunitatea 1 a citocrom C oxidazei 1, COX1). Rezultatele au fost exprimate ca cantități relative de ARNm în comparație cu animalele martor vehicul, utilizând formula .
2,6. Analiză statistică
Analiza statistică a datelor din această lucrare a fost efectuată utilizând analiza de varianță în două direcții urmată de compararea pe perechi a mediilor selectate utilizând testul Student. Criteriul de semnificație a fost stabilit la , , , și în comparație cu martorul.
3. Rezultate
3.1. Greutatea corporală și greutățile umede ale organelor
Răspunsul uterotrofic la șobolanii ovariectomizați a fost măsurat după 3 zile de tratament medicamentos. DBT a fost aplicat în două doze de 0,01 (DBT0,01) și 1 (DBT1) g/kg BW/d. E2 a fost utilizat ca martor pozitiv la 1 μg/kg BW/d, iar uleiul de ricin purtător a fost utilizat ca martor negativ. Aceste tratamente nu au putut avea niciun impact asupra greutății corporale a animalelor [Figura 2(a)]. În ceea ce privește greutatea umedă, tratamentul cu E2 timp de 3 zile a provocat o creștere semnificativă a greutății umede uterine de peste 5 ori, dar nu a afectat greutatea ficatului [Figura 2(b)]. Tratamentul cu DBT, pentru ambele concentrații de DBT0,01 și DBT1, nu a avut niciun efect asupra greutății uterului și a ficatului [Figura 2(b)]. Această observație a fost în concordanță cu expresia ARNm a Ki-67, un marker sensibil de proliferare în uter, care, cu toate acestea, a rămas neschimbată după tratamentul cu DBT [Figura 2(c)]. Expresia ARNm Ki-67 este puternic stimulată ca răspuns la tratamentul cu E2 [figura 2(c)]. În ficat, niciunul dintre tratamente nu a avut un impact semnificativ din punct de vedere statistic asupra expresiei Ki-67 [Figura 2(c)].
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(c)
Efectul E2 sau DBT asupra greutății corporale și a organelor animalelor. (a) Animalele ovariectomizate au fost tratate cu E2 (la 1 μg/kg BW/d; subcutanat) sau DBT (la 0,01 g/kg/d BW și 1 g/kg/d BW, pe cale orală) timp de trei zile; animalele ovariectomizate netratate au servit drept grup de control (Ctrl.). S-a determinat greutatea corporală a șobolanilor înainte de sacrificare. S-au cântărit organele umede, inclusiv uterul și ficatul. (c) Reglarea expresiei ARNm a markerilor de proliferare Ki-67 în uteri și ficat a fost analizată prin analiza semi-cantitativă PCR în timp real. Asteriscurile indică valori semnificativ diferite față de controalele respective. , , , și .
3.2. Expresia genelor asociate estrogenului în uter și ficat
Expresia ARNm a ERα și ERβ a fost detectată în uterul de șobolan în toate condițiile de tratament. După tratamentul cu E2, ARNm ERα și ERβ au prezentat reducerea semnificativă așteptată, în comparație cu animalele de control, în timp ce aplicarea DBT nu a putut afecta expresia ARNm a ERα și ERβ [figura 3(a)]. Pentru acțiunea ER în uter, sunt cunoscute câteva gene marker foarte sensibile care monitorizează răspunsurile estrogenice, și anume, complementul C3 (C3), proteina de legare a calciului 9 kDa (CaBP9k) și clusterina (Clu). În uter, tratamentul cu E2 a dus la o creștere semnificativă de câteva sute de ori a ARNm care codifică C3 și CaBP9k, însoțită de o scădere semnificativă a expresiei ARNm Clu [figura 3(b)]. Aparent, DBT a fost capabilă să declanșeze o upreglare foarte ușoară (care nu depășește de 5 ori) a genelor C3 și CaBP9k reglementate de ER-dependente. Doza mai mare de DBT a provocat o scădere a expresiei ARNm Clu, care nu a atins niveluri de semnificație statistică din cauza deviației standard ridicate a valorii medii (Figura 3(b)).
(a)
(b)
(a)
(b)
Reglarea expresiei receptorilor de estrogen și a genelor de răspuns la estrogen în uter. (a) Expresia ARNm a ERα și ERβ în uteri și (b) expresia ARNm a genelor de răspuns la estrogeni, inclusiv C3, CaBP9k și Clu au fost analizate prin analiza cantitativă PCR în timp real. Asteriscurile indică valori semnificativ diferite față de controalele respective. , , și .
Expresia ARNm a ERα a fost detectată în ficatul de șobolan în toate condițiile de tratament. Răspunsul autoregulator de autoreglare a reducerii ERα de către E2 nu a atins nivelul de semnificație statistică, în timp ce ambele concentrații de DBT au redus nivelurile de ARNm la starea de echilibru ale ERα într-o manieră semnificativă din punct de vedere statistic [figura 4(a)]. Pentru a evalua expresia genelor de răspuns dependente de ERα în ficat, au fost determinate nivelurile de expresie ale genelor adecvate de răspuns la ER specifice ficatului, și anume CaBP9k și proteina I de legare a factorului de creștere asemănător insulinei (IGFBP1). Tratamentul cu E2 a dus la o creștere a expresiei ARNm a CaBP9k și la scăderea expresiei ARNm a IGFBP1 în ficat [Figura 4(b)]. Tratamentul cu o doză mare de DBT (DBT1) a redus semnificativ expresia IGFBP1. Expresia crescută a CaB9k a fost evidențiată după tratamentul cu DBT la ambele concentrații, dar în ambele cazuri nu a atins nivelul de semnificație statistică din cauza variației (Figura 4(b)).
(a)
(b)
(a)
(b)
Reglarea expresiei receptorilor de estrogen și a genelor de răspuns la estrogen în ficat. Expresia ARNm a ERα în ficat (a) și expresia ARNm a genelor de răspuns la estrogeni, inclusiv CaBP9k și IGFBP1 în ficat (b), au fost analizate prin analiza cantitativă PCR în timp real. Asteriscurile indică valori semnificativ diferite față de controalele respective. , , , și .
3.3. Expresia genelor asociate metabolismului lipidic în ficat
Pentru că se crede că DBT crește „Qi”, am investigat expresia genelor asociate cu metabolismul lipidic. Fiind locul principal pentru metabolismul lipidic, funcția ficatului este legată de obezitate, care, la rândul său, este un factor de risc pentru bolile din organele hormono-dependente, cum ar fi cancerul de sân. Prin urmare, am investigat expresia apolipoproteinei A-I (Apo-A1), ca principală componentă a HDL-colesterolului, și a receptorilor activați de proliferatorul peroxisomal (PPAR), care reprezintă senzori de lipide și sunt implicați în diverse moduri în reglarea metabolismului energetic. Upreglarea PPARα de către DBT nu a atins nivelul de semnificație statistică. În ceea ce privește PPARγ, DBT la o concentrație de 1 g/kg BW/d a redus expresia ARNm al acestuia [Figura 5(a)]. Această downreglementare a fost similară cu cea indusă de E2. Dimpotrivă, un efect care a fost în mod clar independent de potențialele proprietăți estrogenice ale DBT a fost reducerea pronunțată a expresiei ARNm PPARδ de către ambele doze de DBT [Figura 5(a)]. Aceste rezultate indică în mod clar faptul că DBT ar putea regla expresia receptorilor intim implicați în reglarea disponibilității și consumului de energie din grăsimi prin modularea expresiei receptorilor din familia PPAR. Ca o legătură potențială cu complicațiile sindromului metabolic, reglementarea metabolismului colesterolului este de interes. Prin urmare, am evaluat reglarea expresiei ARNm al Apo-A1. Modelul de expresie indică o proprietate de tip estrogen al DBT în concentrație de 1 g/kg BW/d, care, ca și E2, a redus expresia ARNm Apo-A1.
(a)
(b)
(a)
(b)
Expresia genică a proliferatorilor de peroxizomi-activated receptors și Apo-A1 în ficat. (a) Expresia ARNm a PPARα, PPARγ și PPARδ în ficat a fost analizată prin analiza PCR cantitativă în timp real. (b) Expresia ARNm a Apo-A1 în ficat a fost analizată prin analiza PCR cantitativă în timp real. Asteriscurile indică valori semnificativ diferite față de controalele respective. , , , și .
3.4. Reglarea DBT asupra căii receptorului de hidrocarburi arilice în uter și ficat
Detoxifierea eficientă este, de asemenea, crucială pentru sănătate. Se știe că receptorul de hidrocarburi arilice (AHR) declanșează expresia enzimelor de metabolizare/detoxifiere în ficat și în alte țesuturi, care acționează în mod coordonat cu bateria de enzime reglementate de Nrf2-. Aici, am investigat expresia AhR, a membrilor familiei AhR și a genelor sensibile la AhR în uter și ficat prin DBT în comparație cu E2. În general, am detectat o reglare specifică țesutului a expresiei AhR, a membrilor familiei AhR și a genelor de răspuns în urma tratamentului cu DBT.
În uter, expresia ARNm AhR a fost puternic reglată în jos ca răspuns la E2, în timp ce nu a fost evidentă nicio alterare ca răspuns la DBT [Figura 6(a)]. Expresia ARNm al ARNm al translocatorului nuclear al receptorului de hidrocarburi arilice 1 (ARNT 1), coregulatorul AHR, a fost reglată în jos de E2, în timp ce DBT la doză mare duce la o creștere a nivelului ARNm al ARNT1 în acest organ. În ceea ce privește ARNT2, a rezultat o scădere puternică a expresiei ARNm în uter ca răspuns la tratamentul cu E2, un efect care nu poate fi detectat ca răspuns la DBT [Figura 6(b)]. Citocromul P450 (familia 1) A1 (Cyp1A1) și Glutation-S-transferazele Ya (GST-Ya) sunt considerate gene de răspuns foarte sensibile pentru funcția AhR. Nivelurile de ARNm Cyp1A1 în uter au fost puternic reglate în jos de E2, un efect detectabil, de asemenea, ca răspuns la ambele doze de DBT, dar la un grad mai mic [figura 6(c)]. Expresia ARNm GST-Ya s-a dovedit a fi crescută doar ca răspuns la E2. Tratamentul cu DBT în ambele doze nu a afectat expresia ARNm GST-Ya în uter [figura 6(c)].
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(c)
Reglarea expresiei de AhR-legate de gene în uter. (a) Expresia ARNm a AhR în uteri, (b) expresia ARNm a ARNT1 și ARNT2 în uteri și (c) expresia ARNm a Cyp1A1 și GST-Ya în uteri au fost analizate prin analiza semi-cantitativă PCR în timp real. Asteriscurile indică valori semnificativ diferite față de controalele respective. , , și .
În ficat, a fost detectabilă o creștere ușoară, nesemnificativă din punct de vedere statistic, a ARNm AhR ca răspuns la tratamentul cu E2, în timp ce DBT a indus puternic expresia ARNm AhR la peste 3 ori (Figura 7(a)). Nivelul ARNm al ARNT1 a putut fi indus doar de doza mică de DBT, dar nu și de E2 și de doza mare de DBT. Mai mult, toate cele trei tratamente au părut să crească expresia ARNT2 mRNA; cu toate acestea, niciuna dintre valori nu a putut atinge nivelul de semnificație statistică [Figura 7(b)]. Tratamentul cu E2 a dus la o creștere ușoară, dar nu semnificativă, a nivelurilor de ARNm Cyp1A1, în timp ce DBT reduce expresia ARNm Cyp1A1 într-o manieră dependentă de doză. Dimpotrivă, tratamentul cu E2 nu a dus la o modificare a expresiei ARNm a GST-Ya, în timp ce DBT în doză mare a redus expresia ARNm a GST-Ya într-o manieră semnificativă din punct de vedere statistic, dependentă de doză [figura 7(c)].
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(c)
Reglarea expresiei de AhR-legate de gene în ficat. (a) Expresia ARNm a AhR în ficat, (b) expresia ARNm a ARNT1 și ARNT2 în ficat și (c) expresia ARNm a Cyp1A1 și GST-Ya în ficat au fost analizate prin analiza semi-cantitativă PCR în timp real. Asteriscurile indică valori semnificativ diferite față de controalele respective. , , și .
4. Discuție
Chiar dacă DBT a prezentat efecte estrogenice potențiale in vitro , informațiile privind activitățile hormonale potențiale ale DBT in vivo sunt limitate. Este bine cunoscut faptul că proliferarea celulelor endometriale se află sub controlul estrogenilor și că riscul de carcinom endometrial crește odată cu terapia de substituție estrogenică . În plus, deoarece compușii naturali cu activități asemănătoare estrogenilor prezintă adesea proprietăți selective de organ in vivo, am evaluat experimentul uterotrofic efectuat în mod dependent de organ. Am evaluat efectele potențiale ale DBT în uter, ca organ al tractului reproducător reprezentând un organ țintă clasic al acțiunii estrogenilor, și în ficat, ca loc metabolic major, fiind unul dintre organele care exprimă predominant ERα. Prin urmare, pentru a studia influența DBT în absența estrogenilor endogeni, am utilizat șobolani femele ovariectomizate pentru a evalua selectivitatea ER a DBT în uter și ficat.
Rezultatele au arătat că DBT nu a modificat greutatea umedă a uterului și a ficatului sau nivelul de expresie a markerilor de proliferare și a ER la niciuna dintre dozele investigate. Pentru acțiunea ER în uter, sunt cunoscute câteva gene marker foarte sensibile care captează răspunsurile estrogenice, și anume, reglarea în sus a C3 și CaBP9k și reglarea în jos a Clu. C3 și CaBP9k ar putea fi suprareglementate de E2, în timp ce Clu a fost reglată în jos ca răspuns la tratamentul cu E2 în uter. DBT a mimat foarte ușor răspunsurile estrogenice pentru C3 și CaBP9k, dar nu și pentru Clu. Acest lucru este interesant, deoarece reglarea ascendentă a C3 și CaBP9k implică elemente de răspuns ERE, în timp ce mecanismul precis de reducere a reglajului negativ al Clu mediat de ER nu este cunoscut. Cu toate acestea, reflectând site-urile de legare a factorilor de transcripție conținute în promotorul Clu, este probabilă implicarea proceselor mediate de SP1 și AP. În paralel, modificările hepatice ale expresiei CaBP9k și IGFBP1 au fost stabilite ca markeri ai răspunsului estrogenic, deși răspunsul global a fost de departe mai mic decât cel detectabil pentru CaBP9k sau C3 în uter. În ficat, DBT a exercitat din nou proprietăți estrogenice slabe în testul uterotrofic de 3 zile. Efectele au fost detectabile doar folosind cei mai sensibili markeri de expresie genetică ai acțiunii estrogenice.
Fierul este în plus un loc major pentru metabolismul lipidic, care este legat de obezitate și care, la rândul său, este un factor de risc pentru bolile din organele dependente de hormoni, cum ar fi cancerul de sân. Prin urmare, am investigat expresia Apo-A1 ca principal component al HDL-colesterolului și a receptorilor PPAR, care sunt implicați în diferite moduri în reglarea metabolismului energetic. Aceștia sunt, de asemenea, ținte cunoscute pentru compușii naturali, iar legarea la aceștia îmbunătățește, de exemplu, absorbția glucozei. Rezultatele noastre indică în mod clar faptul că DBT, prin modularea expresiei receptorilor din familia PPAR, poate contribui la reglarea disponibilității și utilizării energiei din grăsimi. Numeroase recenzii rezumă reglarea căilor metabolice în urma activării PPAR-urilor , un subiect care nu face obiectul acestei lucrări. Cu toate acestea, două caracteristici ale rezultatelor noastre privind PPAR merită discutate. A fost observată o puternică downregulation a PPARδ ca răspuns la DBT. În acest sens, este important de menționat că PPARδ a răspuns la tratamentul cu DBT aparent într-o manieră independentă de estrogen/ER. Consecințele funcționale ale scăderii expresiei PPARδ de către DBT trebuie să rămână deschise în acest moment; cu toate acestea, nu se datorează unei autoregulații a PPARδ ca urmare a legării constituenților DBT, deoarece DBT nu a stimulat nici PPARδ, nici activarea genei reporter dependente de PPARγ într-un test de transfecție tranzitorie (datele nu sunt prezentate). Cu toate acestea, ar fi interesantă activarea unei cascade de semnalizare dependentă de PPARδ de către DBT, deoarece PPARδ este principalul regulator pentru mobilizarea grăsimii și cheltuielile energetice din grăsime și din cauza acestui fenotip potențial legat de obezitate și de prevenirea acesteia.
În schimb, PPARγ, cel puțin la o doză mare de DBT, a răspuns într-o manieră asemănătoare cu cea a estrogenilor, fiind downreglementat. O caracteristică importantă în plus față de proprietățile sale de sensibilizare la insulină ale PPARγ este că determină soarta celulelor stem mezenchimale. Efectele scheletice ale PPARγ sunt bine stabilite între timp. Acesta activează diferențierea adipogenică, inhibând astfel diferențierea osteogenică . Această situație ar fi dezavantajoasă pentru femeile aflate la menopauză și acesta este motivul pentru care downreglarea PPARγ prin DBT poate indica un efect benefic.
Este cunoscut de mult timp faptul că calea AhR declanșează expresia enzimelor metabolizatoare în ficat și în alte țesuturi mai ales într-un mod coordonat cu bateria de enzime reglementate de Nrf2 , contribuind astfel la procesul de detoxifiere. Am arătat recent că există o legătură între funcția estrogenică și reglarea cascadei de semnalizare AhR și a membrilor AhR în uter . Prin urmare, am investigat comparativ reglementarea expresiei AhR, a membrilor familiei AhR și a genelor de răspuns AhR în uter și ficat prin DBT în comparație cu estradiolul. În primul rând, am confirmat modelul de răspuns estrogenic al membrilor bateriei de gene AhR . Pentru tratamentul cu DBT, am detectat în general o reglare specifică țesutului a expresiei AhR, a membrilor familiei AhR și a genelor de răspuns în urma tratamentului cu DBT. Cyp1A1 și GST-Ya, pe lângă faptul că sunt membre ale enzimelor metabolice de primă (Cyp1A1) și de a doua trecere (GST-Ya), sunt considerate gene de răspuns foarte sensibile în ceea ce privește mecanismele de interacțiune care implică căile AhR și ER și au fost testate și aici. Ca o observație interesantă, tratamentul cu DBT a prezentat un model de răspuns asemănător estrogenului pentru reglarea expresiei Cyp1A1, dar nu și pentru GST-Ya, ceea ce indică faptul că funcția DBT în ficat este asociată atât cu proprietăți asemănătoare estrogenului, cât și cu proprietăți independente de estrogen. Se presupune că același lucru este valabil și pentru răspunsurile declanșate de AhR. Pentru viitor va fi interesant de văzut dacă DBT și/sau constituenții săi vor declanșa activități ale genelor reporter mediate de AhR.
În plus, deși în mod slab, am constatat că moleculele ARNT sunt suprareglementate de DBT în ficat. Acest lucru este interesant deoarece unii dintre autorii implicați în această lucrare au descris recent upreglarea HIF1α de către DBT conducând în cele din urmă la upreglarea eritropoietinei . ARNT1 se mai numește și HIF1β și reprezintă partenerul de dimerizare heterodimeric al HIF1α în medierea răspunsurilor sale nucleare . Cu alte cuvinte, arătăm aici că DBT stimulează nu numai HIF1α, ci și HIF1β/ARNT1, sprijinind astfel, potențial, efectul HIF1α asupra eritropoiezei.
În concluzie, am arătat pentru prima dată că DBT reglează nivelurile ARNm ale membrilor cascadei de semnalizare AhR, prezentând astfel atât activități asemănătoare cu cele ale estrogenilor, cât și activități independente de receptorii de estrogeni, conducând, probabil, la un model distinct de mecanisme de detoxifiere. Ultimul rezultat major a fost că efectele DBT par a fi selective pentru organe, influențând funcții relevante pentru sănătatea la menopauză. În ceea ce privește siguranța, nu a existat nicio indicație privind stimularea dependentă de estrogen a proliferării în cadrul organelor din tractul reproducător. În ceea ce privește eficacitatea, DBT prezintă proprietăți estrogenice slabe și reglează expresia unor senzori lipidici interconectați funcțional, care cuprind, printre altele, familiile de molecule PPAR și AhR, aceasta din urmă stabilind o legătură cu detoxifierea și metabolismul energetic. Prin urmare, presupunem că DBT poate avea proprietăți care au un impact direct și indirect asupra sănătății la menopauză.
Abbreviații
| TCM: | Medicina tradițională chineză |
| DBT: | Danggui Buxue Tang |
| ASR: | Angelicae Sinensis Radix |
| AR: | Astragali Radix |
| AhR: | Receptor al hidrocarburilor ariilice |
| Apo-A1: | Apolipoproteina A-1 |
| E2: | 17β-Estradiol |
| ER: | Receptor de estrogen |
| ERE: | Element de răspuns la estrogeni |
| HRT: | Terapie de substituție hormonală |
| PPAR: | Receptor activat de proliferatorul de peroxism. |
Conflict de interese
Autorii declară că nu există niciun conflict de interese în ceea ce privește publicarea acestei lucrări.
Recunoștințe
Această cercetare a fost susținută prin granturi de la Research Grants Council of Hong Kong (HKUST 6419/06 M și N_HKUST629/07, 662608), Fundația Croucher (CAS-CF07/08.SC03) pentru Karl W. K. Tsim, și Fundația Germană de Cercetare (DFG Vo410/6-5) și Serviciul German de Schimb Academic (DAAD 50023165) pentru Günter Vollmer. Colaboratorii de la Universitatea Tehnică din Dresda recunosc sprijinul acordat de Fundația Germană de Cercetare și de fondurile pentru publicații cu acces deschis ale Universității Tehnice din Dresda.
Materiale suplimentare
Analiza expresiei genice a fost efectuată în preparate de ARN din probe de țesut din uter și ficat. Informații privind genele analizate, secvențele de amorsă utilizate, precum și dimensiunile ampliconului sunt prezentate în Tabelul suplimentar 1.
- Materiale suplimentare
.