Abstract
Etiologia bolilor neurodegenerative (ND) pare să implice gene de susceptibilitate și factori de mediu. Metalele toxice sunt considerate poluanți de mediu majori. În urma studiului nostru asupra unui caz de ameliorare a sclerozei multiple (SM) ca urmare a eliminării aluminiului (Al) și a altor metale toxice, am examinat posibila relație dintre intoxicația cu Al și ND. Am utilizat tratamentul intravenos lent cu agentul chelator EDTA (acidul etilicodimetilendiaminotetraacetic disodic de calciu) (testul de chelare) pentru a elimina Al și l-am detectat în urina colectată de la pacienți timp de 12 ore. Pacienții afectați de SM au reprezentat 85,6% din totalul ND. Al a fost prezent în 44,8% din cazurile cuprinzătoare de ND și pacienți sănătoși. Nivelurile de Al au fost semnificativ mai mari la pacienții cu ND decât la subiecții sănătoși. Noi arătăm aici că tratamentul pacienților afectați de povara Al cu zece terapii de chelatare cu EDTA (administrare intravenoasă de EDTA o dată pe săptămână) a fost capabil să reducă semnificativ intoxicația cu Al.
1. Introducere
Expunerea populației umane la metale toxice poate duce la afectarea unei varietăți de sisteme de organe.
Unul dintre cele mai frecvent studiate metale toxice, aluminiul (Al), este implicat în multe boli. Al este un toxic foarte abundent și omniprezent ca toxicitate de mediu și industrială și este, de asemenea, conținut în multe produse alimentare, fiind implicat în boli scheletice, hematologice și neurologice . Toxicitatea Al este cauzată de perturbarea homeostaziei unor metale precum magneziul, calciul și fierul (Fe): de fapt, Al imită aceste metale în funcțiile lor biologice și declanșează numeroase modificări biochimice . În special, Al exercită atât genotoxicitate directă în celulele neuronale umane primare, cât și induce neurodegenerare, printr-o creștere a acumulării de Fe și a producției de specii reactive de oxigen (ROS) . Deteriorarea oxidativă a ADN-ului indusă de Al a fost asociată anterior cu neurodegenerarea în diferite regiuni ale creierului de șobolan . În plus, mai recent, s-a demonstrat că Al3+ provoacă degenerarea neuronilor dopaminergici mediată de transportor la nematodul Caenorhabditis elegans .
Îndepărtarea metalelor toxice din corpul uman poate reprezenta un instrument util pentru a evita debutul sau progresia multor boli legate de intoxicația cu metale.
Metodele utile pentru determinarea conținutului unor metale în probele biologice în scopuri de monitorizare au fost dezvoltate cu câțiva ani în urmă. Într-adevăr, atât metalele toxice, cât și cele esențiale au fost analizate în sânge, urină și păr prin spectroscopie de absorbție atomică . Succesiv, au fost dezvoltate metode de analiză a oligoelementelor în materialele biologice umane, iar spectrometria de masă cu plasmă cuplată inductiv (ICP-MS) a fost considerată preferabilă pentru depistarea mai multor elemente . Cu toate acestea, pare dificil să se demonstreze excesul de metale în sânge și urină în condiții diferite de intoxicația acută cu metale. De fapt, creșterea metalelor toxice din sânge reflectă doar expunerea recentă la metale . După o expunere acută, metalele toxice se deplasează rapid din sânge în multe țesuturi, unde sunt sechestrate, ca în sistemul nervos central (SNC). Singura modalitate capabilă să elimine metalele toxice acumulate din organele umane este de a lega aceste metale prin intermediul agenților chelați, cu scopul de a forma complexe capabile să fie excretate în urină. Nivelurile de metale toxice pot fi examinate în probele de urină recoltate de la pacienți, în urma unei „provocări” cu un agent chelant („test de chelatare”). Am selectat, printre agenții chelați cunoscuți, acidul tetraacetic de calciu disodic etilendiamină (CaNa2EDTA sau EDTA), care a fost administrat intravenos. Constantele de stabilitate ale aluminiului și ale altor metale de interes biochimic cu diverși agenți chelați, inclusiv EDTA, au fost studiate anterior . Elaborarea unui set de constante ale complexelor metalice a servit la corelarea proprietăților chimice și funcționale ale metalelor și a sugerat că EDTA a fost capabil să mobilizeze aluminiul.
În trecut, nivelurile toxice de Al au fost asociate cu bolile neurodegenerative (ND). A fost evidențiată o posibilă legătură între Al și boala Alzheimer . În 1991, s-a raportat că tratamentul cu o doză mică de desferrioxamină (DFO) intramusculară, un chelator trivalent care poate elimina excesul de fier și/sau aluminiu din organism, a încetinit progresia bolii Alzheimer .
În lucrarea de față am decis să studiem dacă Al a fost implicat în neurotoxicitate. Într-adevăr, am evaluat încărcătura corporală de Al la pacienții afectați sau nu de ND. Am studiat, de asemenea, posibila reducere a acestei sarcini în urma tratamentelor cu agentul chelator EDTA.
2. Materiale și metode
2.1. Designul studiului și recrutarea pacienților
Dintre cei 471 de subiecți consecutivi care au fost supuși unui control medical într-un centru medical ambulatoriu, doar 211 au fost selectați și înrolați pentru acest studiu datorită dovezilor privind povara Al și complianța lor în respectarea protocolului, de exemplu, primind terapia de chelatare o dată pe săptămână prin alegere personală. ND examinate în acest studiu au fost scleroza multiplă (SM), scleroza laterală amiotrofică (SLA), boala Parkinson (PD) și boala Alzheimer (AD). Mulți pacienți cu SM fuseseră tratați anterior cu medicamente convenționale utilizate în astfel de patologii (de exemplu, agenți imunosupresori, cum ar fi mitoxantrona și azatioprina, agenți imunomodulatori cu spectru larg, cum ar fi acetat de glatiramer și interferon , și anticorpi monoclonali, cum ar fi rituximab și natalizumab). Unii pacienți cu SM nu fuseseră niciodată tratați anterior cu medicamente. Au fost recrutați, de asemenea, pacienți care nu sunt afectați de boli cunoscute (subiecți sănătoși sau martori), precum și pacienți afectați de patologii non-neurodegenerative (nu ND, care se referă la boli care nu sunt clasificate ca ND, precum fibromialgia). Unii pacienți sănătoși care fuseseră anterior expuși la metale toxice din mediul înconjurător sau de lucru au preferat să își examineze posibila intoxicație prin evaluarea prezenței acestor metale în probele de păr. Într-adevăr, aceștia au fost excluși din prezentul studiu. Toți pacienții și-au dat consimțământul informat pentru a participa la acest studiu. Aceștia aveau vârste cuprinse între 18 și 75 de ani.
2.2. Testul de chelare și evaluarea Al din urină
Pacienții au fost supuși testului de chelare pentru a evidenția o posibilă intoxicație cu Al. Într-adevăr, aceștia au fost invitați să colecteze probele de urină înainte și după tratamentul intravenos cu agentul chelator EDTA (acid etilendiamină tetraacetic, de exemplu, edetat disodic de calciu, 2 g/10 ml diluat în 500 ml de soluție salină fiziologică, Farmax srl, Brescia, Italia). EDTA a fost administrat lent pe cale intravenoasă (perfuzia a durat aproximativ 2 ore) pacienților. Timpul de colectare a urinei după chelare a durat 12 h. Probele recuperate în urma acestei colectări au fost învelite cu precizie în flacoane sterile și transportate la Laboratorul de Toxicologie (Doctor’s Data Inc., St. Charles, IL, SUA), unde au fost prelucrate. Probele au fost supuse unei digestii acide cu acizi certificați fără metale; digestia a avut loc într-un sistem de digestie cu microunde cu vas închis. Pentru diluarea probelor s-a folosit apă ultrapură.
Pentru a evita contaminarea, s-au folosit numai materiale din plastic. Toată vesela de laborator (vârfuri de pipetă, baloane volumetrice etc.) a fost scufundată timp de cel puțin 48 h într-o soluție de HNO3/etanol 10% (v/v) și, cu puțin timp înainte de utilizare, a fost spălată cu apă purificată Milli-Q. Pentru a evita contaminarea din aer, toate etapele de pregătire a probelor și a reactivilor au fost efectuate pe un banc curat de clasa 100.
Testul a fost efectuat prin spectrometrie de masă cu plasmă cuplată inductiv (ICP-MS) utilizând metode de celule de coliziune/reacție cuplate cu chimia ion-moleculelor, o nouă metodă fiabilă de reducere a interferențelor. Metoda a fost utilizată recent pentru biomonitorizarea a 20 de oligoelemente în sângele și urina lucrătorilor expuși la locul de muncă . Standardele de urină certificate și standardele interne au fost utilizate pentru controlul calității și pentru validarea rezultatelor. Pentru a evita marja de eroare potențial mare care poate rezulta din aportul de lichide și volumul probei, rezultatele au fost raportate în micrograme (μg) pe g de creatinină. Creatinina a fost măsurată prin cromatografie lichidă de înaltă performanță în fază inversă și a fost utilizată pentru a corecta volumul total de Al urinar pentru diferențele în ratele de filtrare glomerulară ale indivizilor la momentul prelevării probei punctuale . Programul de cercetare intitulat „Efectele terapiei de chelatare cu EDTA la pacienții afectați de patologii legate de expunerea (acută sau cronică) la metale toxice” a fost aprobat de către Ethical Commitment of The University of Milan (Italia) (numărul 64/2014).
2.3. Evaluarea clinică a ameliorării simptomelor pacientului în SM
În absența unui test de diagnostic specific pentru SM, comunitatea neurologică a adoptat criterii de diagnostic care au fost înlocuite în timp . Imagistica prin rezonanță magnetică (IRM), analiza lichidului cefalorahidian și potențialul vizual evocat, adăugate la diagnosticul clinic, au fost considerate ca prezentând limitări de sensibilitate și specificitate. Succesiv, IRM a căpătat o importanță. Cu toate acestea, diagnosticul de ameliorare a simptomelor pacientului se bazează în prezent pe criterii clinice, precum reducerea dizabilității neurologice (parestezii, ataxie a mersului, spasticitate, nevrită optică și disfuncție urinară) și a oboselii. Uneori, simptomele SLA, ca pareză, atrofie musculară și disartrie, sunt asociate cu RMN și anomalii ale lichidului cefalorahidian tipice SM. Într-adevăr, am considerat ameliorarea simptomelor pacientului recuperarea dizabilității clinice, de exemplu, capacitatea de a munci, reducerea spasticității, întârzierea recidivelor și/sau dispariția oboselii.
2.4. Efectul terapiei de chelatare cu EDTA asupra intoxicației cu Al
Pacienții care au evidențiat intoxicație cu Al (prin examinarea nivelului acestuia în probele de urină) au fost supuși terapiei de chelatare cu EDTA. EDTA (2 g în 500 ml de soluție salină fiziologică) a fost perfuzat intravenos la fiecare pacient în aproximativ 2 ore. Tratamentul a fost administrat o dată pe săptămână și a durat zece săptămâni. La sfârșitul tratamentelor, nivelurile de Al din urină au fost analizate, așa cum a fost descris anterior.
2.5. Analiza datelor
Analiza statistică a fost efectuată utilizând Microsoft Excel 2010 și IBM SPSS Statistics 20 (IBM Armonk, New York, SUA). O analiză de regresie logistică a fost utilizată pentru a examina contribuțiile relative ale mai multor variabile la rezultatele operației. a fost considerată semnificativă.
3. Rezultate
3.1. Caracteristicile pacienților
Figura 1 raportează distribuția pacienților care au prezentat intoxicație cu Al.
Schema caracteristicilor subiecților înrolați.
Cei mai reprezentați pacienți afectați de ND au fost cei cu SM (85,6% din totalul ND). Într-adevăr, am comparat atât grupul de pacienți cu SM, cât și grupul de pacienți cu ND cu grupul de pacienți sănătoși.
3.2. Intoxicația cu Al
Toți pacienții nu au prezentat intoxicație cu Al înainte de provocarea cu EDTA (datele nu sunt prezentate). Toți pacienții afectați de ND au prezentat intoxicație cu diferite metale toxice (date neprecizate). După provocarea cu EDTA, Al a fost prezent în 44,8% din cazurile cuprinzătoare de ND și pacienți sănătoși. Nivelurile de intoxicație cu Al, așa cum au fost obținute din evaluarea conținutului de Al în μg/g de creatinină în probele de urină recoltate după primul tratament intravenos cu EDTA (testul de chelatare), sunt raportate în figura 2. Datele indică faptul că valorile Al au fost semnificativ mai mari în probele de urină ale pacienților cu SM și ND decât în cele ale pacienților sănătoși.
Nivelurile de aluminiu (Al) evaluate în probele de urină ale subiecților examinați, în urma testului de chelatare (întuneric) și după zece terapii de chelatare cu EDTA (lumină), exprimate ca medie ± SEM de μg/g creatinină. Subiecții studiați au fost pacienți sănătoși, pacienți afectați de scleroză multiplă (SM) și pacienți afectați de toate bolile neurodegenerative (ND). Nivelurile de Al atât la pacienții cu SM, cât și la cei cu ND au fost semnificativ mai mari în raport cu cele obținute la subiecții sănătoși în urma testului de chelare ( față de cei sănătoși). După terapiile de chelatare cu EDTA, nivelurile de Al au fost semnificativ mai mici decât cele obținute în urma testului de chelatare (# față de și ## față de ).
3.3. Utilitatea terapiei de chelatare cu EDTA
Efectul terapiei de chelatare cu EDTA este raportat și în figura 2. Într-adevăr, pacienții care au prezentat intoxicație cu Al în urma testului de chelatare au fost supuși unei terapii de chelatare (administrare intravenoasă de EDTA o dată pe săptămână). După zece terapii, nivelurile de Al din probele de urină au fost evaluate în continuare și comparate cu cele obținute în urma testului de chelatare. Administrarea de EDTA s-a dovedit a fi semnificativ eficientă în eliminarea încărcăturii de Al, după cum se arată în figura 2. Rezultatele noastre au arătat că reducerea timpului de intoxicare cu Al este bine corelată cu îmbunătățirea condițiilor clinice ale pacienților. De fapt, aceștia au prezentat, în grade diferite, reducerea dizabilității neurologice și a oboselii.
De remarcat faptul că eficacitatea terapiei de chelatare cu EDTA a fost mai evidentă la ND decât la pacienții sănătoși.
4. Discuție
Metalele toxice, pesticidele și fenolii sunt considerați poluanți majori ai mediului . Metalele toxice sunt clasificate ca substanțe non-biodegradabile, la fel ca și materialele plastice și detergenții, deoarece nu sunt degradate de microorganisme. Ele reprezintă un risc global pentru sănătate din cauza capacității lor de a contribui la o varietate de boli. În acest context, Al (care este un element extrem de reactiv și un contaminant omniprezent în mediu) a fost asociat cu unele boli . De fapt, osteomalacia este o boală a scheletului legată de efectele toxice ale Al, cum ar fi deficiența de fosfat, afectarea absorbției de Ca și proliferarea disfuncțională a osteoblastelor . În plus, expunerea la Al poate afecta absorbția intestinală a Fe, favorizând o stare anemică . În plus, Al poate juca un rol activ în mecanismele patogenetice ale bolilor neurologice. În special, s-a demonstrat că Al este responsabil pentru leziunile neuropatologice critice din AD și alte afecțiuni asociate, datorită capacității sale de a reticula proteinele hiperfosforilate . Al a fost detectat în fibrele amiloide din miezul plăcilor senile din creierul pacienților cu AD . Prezența Al în sistemele biologice ar putea conduce la o importantă activitate prooxidantă, prin promovarea generării de superoxid prin reacția Fenton . Mai recent, a fost propusă eliminarea Al la pacienții cu AD prin tratament cu DFO . Tratamentul cu succes cu DFO (atât la doze mici, cât și la doze standard) a fost efectuat pentru supraîncărcarea cu Al în rândul pacienților cu hemodializă . Mai mult, s-a demonstrat că DFO este capabil să exercite efecte protectoare în țesutul cerebral al șoarecilor împotriva alterărilor structurale și metabolice induse de Al . Cu toate acestea, deoarece unii pacienți pot avea intoleranță la DFO sau pot dezvolta efecte secundare ale DFO, cum ar fi reacții alergice, simptome neurologice sau tulburări gastrointestinale evidente, am decis să folosim EDTA ca agent de chelatare. Acidul chelator N-(2-hidroxietil) etilendiamină triacetic (HEDTA), similar cu EDTA, s-a dovedit a fi eficient, de asemenea în asociere cu seleniu, împotriva stresului oxidativ indus de Al în creierul de șobolan .
Excreția urinară crescută de Al și Fe a fost demonstrată anterior la pacienții cu SM .
Am studiat anterior cazul unui tânăr afectat de SM, care a fost tratat fără succes timp de câțiva ani cu terapiile actuale . Simptomele dezvăluite de pacient au fost pierderea subacută a vederii, diplopia și durerea la mișcările oculare ca primele simptome de nevrită optică; perturbarea abilităților motorii fine; parestezia și ataxia mersului; disfuncția vezicii urinare și oboseala semnificativă. I-am examinat nivelurile de metale toxice din urină, în urma unei „provocări” intravenoase cu EDTA. Pacientul a prezentat niveluri ridicate de Al, Pb și Hg în urină. Într-adevăr, el a fost supus unui tratament cu EDTA de două ori pe lună. Sub tratament, pacientul a prezentat în timp o ameliorare a simptomelor care sugerează o remisiune a SM. De fapt, acesta și-a recăpătat vederea ochilor și funcția vezicii urinare și au dispărut paresteziile, precum și oboseala. Deoarece metalul toxic cel mai reprezentat la acest pacient a fost Al, am decis să examinăm posibila relație a intoxicației cu Al cu ND.
Rezultatele noastre arată că nivelurile de Al măsurate în probele de urină ale pacienților afectați atât de SM studiată separat, cât și de ND totală studiată, au fost semnificativ mai mari decât cele ale pacienților sănătoși, așa cum este raportat în figura 2. Pacienții sănătoși au prezentat aproximativ 80 μg/g creatinină, ca nivel mediu de Al, chiar dacă valorile normale sunt de 35 μg/g creatinină. Aceste date sugerează că intoxicația cu Al nu este neapărat legată de debutul simptomelor clinice ale ND. Mai mult, este posibil ca pacienții de control să fie capabili să limiteze sarcina suplimentară de Al prin mecanisme neuroprotectoare sau antioxidante care sunt absente la pacienții cu ND. Evaluările clinice ale fiecărui pacient au sugerat prezența unei relații importante între intoxicația cu Al și afectarea mișcărilor, parestezii, ataxie și alte simptome prezentate de subiecții afectați de ND. Într-adevăr, pacienții care au prezentat valori maxime de Al în proba de urină au prezentat, de asemenea, cele mai grave caracteristici ale bolii la nivel clinic. Obiecției că mobilizarea (prin agenți chelați) a Al din situsuri relativ sigure, cum ar fi osul, și depunerea acestui metal extrem de neurotoxic în SNC poate fi periculoasă i se opune considerentul că pacienții afectați de ND erau afectați de încărcătura de Al (responsabilă de patogeneza bolii) în SNC înainte de chelare. Mai mult decât atât, complexele formate de metalul toxic cu agenții chelatori sunt bine eliminate de rinichi. Studii recente au demonstrat că deficitele motorii comportamentale severe și pierderea neuronilor motori prin sistemul nervos au rezultat atunci când un adjuvant al vaccinului cu Al a fost aplicat la un model animal. Într-adevăr, șoarecii injectați cu hidroxid de Al au prezentat o creștere semnificativă a morții celulare în măduva spinării și cortexul motor, afectând în primul rând neuronii motori și inducând neuroinflamarea. Efectele s-au asemănat foarte mult cu leziunile observate în ALS umană .
După cum s-a raportat recent, sistemul imunitar pare să fie, de asemenea, sensibil la expunerea la Al . Efectele Al asupra autoimunității, toleranței orale, expresiei CD4+ și CD8+, hipersensibilității și funcției imune eritrocitară sunt sugestive pentru activitatea sa imunotoxicologică. S-a sugerat că multe dintre caracteristicile neurotoxicității induse de Al pot apărea în parte din reacții autoimune .
În cele din urmă, într-un raport recent al lui Exley C Al este considerat un potențial contribuitor la apariția, progresia și agresivitatea ND, chiar dacă pare a fi dificil de stabilit când contribuie la etiologia bolii. Cu toate acestea, din moment ce Al reprezintă un risc pentru sănătatea umană, este necesar să se pună în aplicare măsuri pentru a reduce încărcătura sa corporală la cea mai mică limită practică.
Ce strategie pentru terapia comună a leziunilor provocate de metale toxice poate fi propusă? Absorbția intracelulară a metalelor toxice ar fi prevenită în mod adecvat prin inhibitori relevanți (chelatori), în timp ce generarea ROS și procesele mediate de ROS ar fi prevenite sau ameliorate prin antioxidanți relevanți și captatori de radicali liberi și Fe.
În experiența noastră, așa cum s-a demonstrat în studiile anterioare și în cele prezente, îndepărtarea metalelor toxice a indus efecte benefice prin îmbunătățirea simptomelor pacienților . Nu au fost observate efecte adverse în urma tratamentelor cu EDTA. Îndepărtarea metalelor a părut treptată în timp și a sugerat multe terapii de chelatare. În concluzie, în studiul de față arătăm că terapia de chelatare cu EDTA a fost capabilă să reducă povara Al la pacienții afectați de ND prin ameliorarea stării lor clinice. Sperăm că în viitor un astfel de tratament va fi considerat un instrument util pentru îmbunătățirea simptomelor pacienților cu ND.
Conflict de interese
Autorii declară că nu există niciun conflict de interese în ceea ce privește publicarea acestei lucrări.
.