FOOD MICROBIOLOGY
Isolarea bacteriocinelor producătoare de bacteriocine-…producing lactic acid bacteria from meat and meat products and its spectrum of inhibitory activity
Isolamento de bactérias lácticas produtoras de bacteriocinas a partir de carnes e produtos cárneos e seu espectro de atividade inhibitória
Renata Bromberg; Izildinha Moreno; Cíntia Lopes Zaganini; Roberta Regina Delboni; Josiane de Oliveira
Instituto de Tecnologia de Alimentos, Campinas, SP, Brasil
Correspondență
ABSTRACT
Un total de 285 de probe de carne și produse din carne au fost evaluate pentru prezența bacteriilor lactice producătoare de bacteriocine prin testul „sandwich”. Din 174 dintre aceste probe, au fost izolate 813 tulpini de bacterii lactice. Acestea au fost capabile să inhibe creșterea Staphylococcus aureus CTC 33 și/sau Listeria innocua Lin 11. Atunci când au fost evaluate prin testul de difuzie, 128 dintre aceste tulpini au inhibat creșterea tulpinilor indicatoare. Spectrele de activitate inhibitorie ale izolatelor au fost evaluate față de o serie de organisme de testare Gram-pozitive și Gram-negative. S. aureus a fost cel mai sensibil indicator testat, în timp ce Enterococcus faecalis și Lactobacillus plantarum au fost cele mai rezistente. Toți compușii produși de bacteriile lactice au fost inactivate total sau parțial de unele dintre enzimele proteolitice, ceea ce indică natura lor proteică. Activitatea antimicrobiană a bacteriocinelor produse de bacteriile lactice izolate în această lucrare ar putea acționa ca o potențială barieră pentru a inhiba dezvoltarea bacteriilor de alterare și a agenților patogeni de origine alimentară.
Cuvinte cheie: bacteriocine, bacterii lactice, carne, activitate inhibitoare.
RESUMAT
Un total de 285 de mostre de carne și produse carnale au fost evaluate pentru detectarea culturilor producătoare de bacteriocine prin metoda „sanduíche”. Din 174 dintre aceste probe, au fost izolate 813 tulpini de bacterii lactice cu activitate inhibitoare asupra Staphylococcus aureus CTC 033 și/sau Listeria innocua Lin 11. Atunci când au fost examinate prin metoda antagonismului simultan în godeuri, 128 dintre aceste tulpini au inhibat creșterea microorganismelor indicatoare. Spectrul de activitate al tulpinilor izolate a fost evaluat cu diferite microorganisme Gram-pozitive și Gram-negative. În general, S. aureus a fost cel mai sensibil microorganism indicator, în timp ce Enterococcus faecalis și Lactobacillus plantarum au fost cele mai rezistente. Toți compușii antimicrobieni produși de bacteriile lactice testate au fost inactivate complet sau parțial de enzimele proteolitice, ceea ce indică natura lor proteică. Activitatea antimicrobiană a bacteriocinelor produse de tulpinile de bacterii lactice izolate în această lucrare poate acționa ca o barieră potențială pentru a inhiba creșterea bacteriilor patogene de origine alimentară și a celor de stricăciune.
Palavras-cheie: bacterrias lácticas, bacteriocinas, carne, atividade inhibitória.
INTRODUCERE
Recent au fost făcute încercări de a aplica tehnici de bioconservare la produsele din carne (18). Acestea au implicat introducerea unei microflore competitive de bacterii lactice ca culturi protectoare pentru produsele din carne, inclusiv bacterii lactice producătoare de bacteriocine și bacteriocine anti-listeriene purificate (12). Având în vedere că bacteriile producătoare de bacteriocine sunt izolate din alimente care conțin în mod normal bacterii lactice, cum ar fi carnea și produsele lactate, acestea au fost consumate de mult timp. Bacteriocinele produse de bacteriile lactice sunt definite ca fiind produse extracelulare primare sau modificate ale sintezei ribosomale bacteriene, care pot avea un spectru relativ îngust de activitate bactericidă (4). Tulpinile producătoare de bacteriocine pot fi utilizate ca parte sau ca adjuvant al culturilor starter pentru alimentele fermentate, pentru a îmbunătăți siguranța și calitatea. În acest context, bacteriocinele produse de bacteriile lactice asociate cu carnea, cum ar fi Pediococcus, Leuconostoc, Carnobacterium și Lactobacillus spp. sunt susceptibile de a avea un potențial mult mai mare ca agenți de conservare a cărnii (3,31,33,38). Posibilitatea de a exploata bacteriocinele în fermentarea alimentelor apare în cazul în care spectrul inhibitor include microorganisme de alterare a alimentelor și/sau microorganisme patogene, ceea ce conferă tulpinii producătoare un avantaj competitiv în alimente. Un avantaj important al bacteriocinelor față de antibioticele clasice este faptul că enzimele digestive le distrug (4). Acest fapt indică faptul că ingestia acestor compuși nu va altera ecologia tractului digestiv și, de asemenea, că nu va cauza riscuri legate de utilizarea antibioticelor obișnuite.
Bacteriocinele ar putea fi aplicate în tehnologia hurdle, care profită de sinergiile tratamentelor combinate pentru a conserva mai eficient alimentele (6). Utilizarea nizinei, o bacteriocină produsă de Lactococcus lactis ssp., este permisă în prezent în aproximativ 50 de țări. Cu toate acestea, unii cercetători au ajuns la concluzia că nizina nu este eficientă în aplicarea în cazul cărnii din cauza pH-ului ridicat (24), a dificultății de a distribui uniform bacteriocina în întregul aliment și a interferenței componentelor cărnii, cum ar fi fosfolipidele (8) și glutationul (26). Din cauza dificultăților de utilizare a nizinei în aplicațiile din carne, ar trebui să se continue căutarea de noi culturi producătoare de bacteriocine.
Scopul acestui studiu a fost de a examina o gamă de carne și produse din carne pentru a detecta prezența tulpinilor producătoare de bacteriocine care ar putea fi valoroase pentru utilizarea în strategiile de bioconservare a produselor din carne. Astfel, a fost evaluat potențialul izolatelor de a inhiba alterarea alimentelor și a bacteriilor patogene de origine alimentară.
MATERIALE ȘI METODE
Sușe bacteriene și medii de creștere
Sușe utilizate în acest studiu sunt enumerate în tabelul 1. Bacteriile alese ca indicatori au fost Staphylococcus aureus CTC 33 (Instituto de Tecnologia de Alimentos – ITAL, Campinas, Brazilia), Listeria innocua Lin 11 (Institutul Pasteur, Paris, Franța) și Bacillus cereus CTC 1 (ITAL). Lactobacillus casei LC 705 (Wiesby), care produce bacteriocine, a fost utilizat ca martor pozitiv. Culturile stoc de bacterii lactice și celelalte microorganisme au fost menținute la -80ºC în bulion de Man Rogosa Sharpe (MRS, Oxoid Ltd., Basingstoke, Regatul Unit) sau în bulion de soia triptică (TSB, Oxoid) suplimentat cu 15% glicerol. Culturile de lucru au fost pregătite sub formă de pastă pe agar MRS pentru bacteriile lactice sau pe agar TSA cu 0,6 % extract de drojdie (Oxoid) pentru indicatori și au fost păstrate la 4ºC. Culturile destinate experimentelor au fost striate o dată pe săptămână și inoculate în mediu de la o singură colonie și incubate timp de 24 h. Înainte de utilizare, culturile de bacterii lactice au fost transferate de două ori în mediul adecvat și incubate în conformitate cu condițiile prezentate în tabelul 1.
Eșantioane
Au fost analizate două sute optzeci și cinci de eșantioane dintr-o varietate de carne și produse din carne obținute de la diferiți producători brazilieni. Acestea au inclus carne proaspătă, produse din carne crudă, gătită, maturată, uscată sau fermentată. După ce au fost cumpărate de pe piața de vânzare cu amănuntul, toate probele au fost depozitate la 3 ± 1ºC timp de maximum 24 de ore înainte de analiză.
Isolarea bacteriilor lactice producătoare de bacteriocine din carne
O porție de 25 g din fiecare probă de carne a fost transferată aseptic într-o pungă stomacher sterilă și s-au adăugat 225 ml de apă peptonată tamponată (Buffered Peptone Water, BPW, Oxoid) pentru a obține o diluție de 1:10. Probele au fost amestecate timp de 1 minut cu ajutorul unui stomacher (Model 400 – BA 7021, Seward Medical, Londra, Regatul Unit). S-au făcut diluții în serie ale probelor în apă peptonată 0,1%. Pentru detectarea activității antagoniste, s-a utilizat un test „sandwich” (37). În acest scop, diluțiile au fost inoculate (placă turnată) pe agar MRS suplimentat cu 0,01% sodiumazidă pentru a inhiba bacteriile Gram-negative. Activitatea inhibitoare a peroxidului de hidrogen a fost eliminată prin adăugarea de catalază (Sigma Chemical Co., Dorset, Regatul Unit) la o concentrație finală de 100 U. Pentru a exclude orice inhibiție datorată reducerii pH-ului cauzată de producerea de acid organic, s-a adăugat b-glicerofosfat de sodiu 2% (Ecibra, Brazilia) în agar MRS. Plăcile au fost acoperite cu același mediu pentru a exclude inhibiția datorată bacteriofagilor litici, care sunt entități care nu difuzează, urmată de o incubare aerobă la 35ºC timp de 48 de ore pentru a permite dezvoltarea coloniilor.
După perioada de incubare, plăcile care conțineau până la 102 UFC au fost suprapuse cu 4,5 ml de TSB moale (conținând 0,75% agar). Agarul suprapus a fost însămânțat cu 500 ml de S. aureus CTC 33 sau L. innocua Lin 11 la un nivel de 106 până la 107 UFC/mL. Plăcile au fost incubate la 35ºC timp de 24 h. Liza tulpinilor indicatoare a dus la apariția unei zone clare. Coloniile care prezintă zone de inhibiție au fost transferate pe TSB și incubate la 30ºC timp de până la 72 de ore. Culturile au fost purificate pe plăci de agar MRS și incubate la 30ºC timp de 18 ore. Izolatele purificate au fost examinate prin colorare Gram și prin producerea de catalază, testată în conformitate cu Harrigan și McCance (10).
Detecția activității antagoniste
Producția de bacteriocine de către bacteriile lactice izolate din carne și produse din carne a fost analizată prin metoda agar well-diffusion conform lui Benkerroum și colab. (1), aceasta fiind o modificare a celei descrise de Tagg și McGiven (35). Plăcile au fost examinate pentru a se vedea dacă există liză în jurul godeurilor la diferite intervale de timp, timp de 24 de ore. S-a făcut o comparație directă între diametrele zonelor de inhibiție produse de diferite tulpini.
Spectrul activității inhibitoare a bacteriocinelor
Culturile producătoare de bacteriocine izolate din carne și produse din carne au fost, de asemenea, testate împotriva tulpinilor de bacterii prezentate în tabelul 1. Testul de difuzie a fost utilizat așa cum a fost descris anterior. Tulpinile care au prezentat un spectru larg de activitate au fost, de asemenea, testate folosind testul de diluție critică al lui Mayr-Harting și colab. (19). Titlul a fost definit ca fiind reciproca celei mai mari diluții care prezintă o inhibiție a tulpinii indicatoare înmulțită cu 100 pentru a exprima rezultatele ca unități de activitate pe mililitru (UA/mL).
Sensibilitatea substanței de tip bacteriocină la enzime
Supranatantele fără celule din culturile de acid lactic au fost colectate prin centrifugare (7.500 g, 10 min, 4ºC) a culturilor de bulion MRS de peste noapte. Lichidele supranatante au fost ajustate la pH 6,5 cu 10 N NaOH și expuse la căldură (95ºC timp de 5 min) într-o baie de apă clocotită. Supernatantele au fost tratate cu următoarele enzime la o concentrație finală de 0,2 mg/mL: ficină (Sigma Chemical Co, Dorset, Anglia) în 20 mM de fosfat de sodiu, pH 7,0; tripsină (Sigma) în 40 mM de Tris-HCl, pH 8,2; a-chimotripsină (Sigma) în 20 mM de Tris-HCl, pH 8,0; pronază E (Sigma) în 20 mM de Tris-HCl, pH 7,0; pronază E (Sigma) în 20 mM de Tris-HCl, pH 7,0.8; pepsină (Merck Darmstad, Germania) în HCl 0,002 N; lipază (Merck) în fosfat de potasiu 0,1 M, pH 6,0; papaina (Sigma) în acetat de fosfat de sodiu 0,05 M, pH 7,0. Toate aceste soluții au fost sterilizate prin filtrare prin filtre Millex GV 0,22 m (Millipore S.A., St. Quentin-en-Yvelines, Franța) și apoi au fost adăugate la supranaturile sterile fără celule (v/v, 1/1). Controalele au constat în soluții enzimatice fără bacteriocină și numai în supranatant fără celule în tampon fosfat de sodiu 0,1 M. Probele și controalele au fost incubate la 37ºC timp de 2 ore și au fost încălzite în apă clocotită timp de 5 minute pentru a inactiva enzimele. Activitatea bacteriocinică rămasă a fost determinată prin testul de diluție critică al lui Mayr-Harting et al. (19), așa cum s-a descris anterior, folosind B. cereus CTC 1 ca tulpină indicatoare.
REZULTATE ȘI DISCUȚII
Izolarea și depistarea bacteriilor
Din moment ce bacteriile producătoare de bacteriocine izolate din carne și produse sunt bine adaptate la aceste condiții, ele ar putea asigura siguranța și prelungi durata de conservare a acestor alimente. Prin urmare, s-a efectuat o căutare a activităților antagoniste împotriva bacteriilor patogene și de alterare a alimentelor, în izolate dintr-o serie de carne și produse din carne.
Conform rezultatelor, dintr-un total de 285 de probe diferite de carne proaspătă și produse din carne analizate, 174 au prezentat tulpini de bacterii lactice care s-au dovedit a produce substanțe asemănătoare bacteriocinelor prin testul „sandwich”. Din fiecare dintre aceste probe, au fost izolate cel puțin 4 colonii capabile să inhibe S. aureus CTC 33 și/sau L. innocua Lin 11, reprezentând un total de 813 colonii. De Martinis et al. (7) au analizat douăzeci de probe de carne și produse din carne din Brazilia și au izolat patru bacterii lactice producătoare de bacteriocine care prezentau activitate antilisterică.
După purificare, culturile au fost apoi verificate în ceea ce privește producția de bacteriocine folosind testul well-diffusion. Prin această metodă, prin inocularea godeurilor cu culturi de bulion de diferite microorganisme indicatoare, se pot face comparații între producția de bacteriocine a diferitelor tulpini care cresc în condiții identice. Din cele 813 izolate, numai 128 (15,7 %) au produs zone de inhibiție pe agar MRS. Aceste tulpini producătoare de bacteriocine erau toate Gram-pozitive și catalazei negative, 75,8% fiind cocci și 24,2% bastonașe. Schillinger și Lücke (28) au obținut rezultate similare în urma verificării tulpinilor de Lactobacillus sake care au fost pozitive la testul spot în agar și negative la testul de difuzie: dintr-un total de 19 tulpini, numai șase au produs zone de inhibiție pe agar în testul de difuzie. Lewus et al. (16) au constatat că numai câteva dintre tulpinile care au fost testate pozitiv prin metoda „spot-on-the-lawn” au dat rezultate pozitive în testul de difuzie bine. Aceștia au considerat că acordarea unui anumit timp pentru ca bacteriocinele să se difuzeze în agar înainte de incubare sau creșterea dimensiunii godeurilor, astfel încât să se poată aplica mai multe probe, ar putea crește sensibilitatea testului. Potrivit acestor autori, agregarea, bacteriocinele care nu pot fi difuzate, inactivarea proteazei și efectele concentrației, toate acestea pot duce la rezultate fals negative în testul de difuzie în gode.
Rezultatele testului well-diffusion au arătat că 64,1% dintre tulpinile izolate au inhibat doar S. aureus, iar 11,7% au prezentat activitate inhibitoare doar împotriva L. innocua, în timp ce 24,2% dintre izolatele din carne care au inhibat S. aureus au inhibat și L. innocua. Potrivit lui Lewus et al. (16), microorganismul indicator utilizat în screeningul inițial trebuie să reflecte aplicația finală sau propusă a tulpinii producătoare de bacteriocine. S. aureus și Listeria sp. sunt adesea prezente în țesuturile proaspete, deoarece procesul de sacrificare nu include o etapă bactericidă. Dezvoltarea S. aureus în alimente reprezintă un potențial pericol pentru sănătatea publică, deoarece multe tulpini de S. aureus produc enterotoxine care provoacă intoxicații alimentare dacă sunt ingerate. Carnea și produsele din carne sunt frecvent asociate cu intoxicațiile alimentare stafilococice (25,36). Specii de Listeria au fost găsite în carne și produse din carne (13). Transmiterea prin alimente a L. monocytogenes a fost implicată în focare umane de listerioză care au implicat consumul de diverse alimente (9,17,29). L. innocua este frecvent izolată din carne și, adesea, incidența acestui organism este mai mare decât cea a L. monocytogenes (2). A fost propusă utilizarea altor specii de Listeria decât L. monocytogenes ca indicatori ai prezenței acestui organism (39).
Fig. 1 prezintă grupele de probe de carne și produse din carne care au prezentat bacterii lactice producătoare de bacteriocine, conform testului „sandwich” și testului de difuzie bine. Cu toate acestea, nu toate bacteriile izolate prin testul „sandwich” au fost confirmate în testul de difuzie bine. Testul „sandwich” a prezentat 174 (61,0%) de probe pozitive pentru organisme producătoare de bacteriocine, dintre care doar 55 (31,1%) au fost testate pozitiv în testul de difuzie bine. Conform testului „sandwich”, majoritatea bacteriilor producătoare de bacteriocine au fost izolate din produse din carne maturate, uscate sau fermentate (78,4%). Nu același lucru a fost observat în testul de difuzie: carnea proaspătă a avut cel mai mare număr de bacterii producătoare de bacteriocine (27,5%). Pe de altă parte, ambele metode au arătat că produsele din carne gătită conțineau mai puține probe cu bacterii lactice pozitive pentru substanțe asemănătoare bacteriocinelor.
Aceste rezultate negative ar putea arăta că producția de bacteriocine nu este foarte conservată la aceste tulpini. Unele dintre bacteriocine sunt proteine mediate de plasmide (34), astfel încât ar trebui să se ia în considerare posibilitatea ca unele culturi să își fi pierdut plasmidele după transferuri consecutive în timpul purificării.
Spectrele de activitate inhibitorie
Activitatea față de 18 tulpini indicatoare, a compușilor antibacterieni produși de izolatele bacteriene, este prezentată în (tabelul 2). Aceste tulpini au prezentat un spectru inhibitor larg, deoarece au fost capabile să inhibe multe dintre tulpinile indicatoare testate. Aceste date sugerează că ar trebui utilizate mai multe microorganisme indicatoare diferite în testele de depistare a bacteriocinelor, pentru a evita ratarea unui producător. Dintre toate tulpinile indicatoare testate, S. aureus CTC 33, Cl. sporogenes CTC 6 și B. cereus CTC 1 au fost cele mai sensibile, fiind inhibate de cel mai mare număr de culturi, în timp ce Ent. faecalis ATCC 19433, Lb. plantarum TECNOLAT 434, clostridiile sulfito-reducătoare CTC 5, Leuc. mesenteroides ATCC 10830 și W. viridescens CCT 849 au fost inhibate de un număr mic de tulpini. Dintre tulpinile testate pentru producția de bacteriocine, niciuna nu a prezentat activitate inhibitoare împotriva tuturor indicatorilor. Doar 4 tulpini (CTC 165, CTC 376, CTC 469 și CTC 484) au inhibat majoritatea tulpinilor indicatoare testate (datele nu sunt prezentate).
Majoritatea inhibițiilor cauzate de tulpinile de acid lactic au produs zone de inhibiție „scăzute” (raza zonei de eliminare a fost mai mică de 3 mm). Lb. helveticus (Wiesby) a fost un indicator foarte sensibil, deoarece 90,2% din inhibiția cauzată de bacteriocinele testate pe această bacterie a produs zone de inhibiție „ridicată” (raza zonei de degajare a fost mai mare de 5 mm). Culturile care au produs zone de inhibiție „înalte” față de tulpinile indicatoare au fost: CTC 3, CTC 12, CTC 35, CTC 36, CTC 38, CTC 40, CTC 49, CTC 51, CTC 78, CTC 141, CTC 142, CTC 144, CTC 172, CTC 176, CTC 185, CTC 204, CTC 205, CTC 206, CTC 210, CTC 211, CTC 212, CTC 231, CTC 253, CTC 330, CTC 346, CTC 352, CTC 359, CTC 375, CTC 376, CTC 377, CTC 378, CTC 396, CTC 404, CTC 469, CTC 483, CTC 484 și CTC 485 în raport cu Lb. helveticus; tulpinile CTC 78 și CTC 172 împotriva B. cereus CTC 001; tulpina CTC 172 împotriva Cl. sporogenes CTC 006; și tulpina CTC 332 împotriva Cl. perfringens CTC 42.
Câteva tulpini au produs substanțe de tip bacteriocină care au inhibat bacteriile Gram-negative testate: Pseudomonas sp. CTC 32 a fost inhibată de 61 (47,6%) tulpini, E. coli ATCC 25422 de 49 (38,3%) tulpini, iar Salm. typhimurium ATCC 14028 de 48 (37,5%) tulpini. Ținta bacteriocinelor este membrana citoplasmatică, astfel încât, datorită barierei de protecție asigurată de LPS din membrana externă a bacteriilor Gram-negative, bacteriocinele sunt, în general, active numai împotriva celulelor Gram-pozitive (32). Cu toate acestea, tulpinile mutante sau protoplastele de bacterii Gram-negative au devenit sensibile la acțiunea bacteriocinelor după expunerea la un stres sub-letal, cum ar fi încălzirea, congelarea sau decongelarea, care perturbă membrana externă și permit accesul bacteriocinelor la membrana citoplasmatică, ceea ce duce la o sensibilitate crescută (11,30,32).
Dintre cele 128 de culturi testate pentru activitatea antimicrobiană, cele 12 care au inhibat cel mai mare număr de indicatori au fost testate cu ajutorul testului Mayr-Harting et al. (19) (tabelul 3). Conform rezultatelor, B. cereus CTC 1 și L. monocytogenes CTC 21 au fost cele mai sensibile microorganisme testate, deoarece tulpinile de acid lactic analizate au inhibat 100% și, respectiv, 91,7% dintre acestea. S-a observat o variație în ceea ce privește nivelul de inhibiție între tulpinile indicatoare testate. W. viridescens CCT 849 a fost cea mai rezistentă, deoarece a prezentat cea mai mică valoare de activitate. B. cereus ATCC 14579, Leuc. mesenteroides ATCC 10830 și clostridiumul sulfito-reducător CCT 5 au prezentat un model de sensibilitate intermediar, în timp ce S. aureus CTC 33, L. innocua Lin 11, L. monocytogenes CTC 21 și Cl. perfringens CTC 42 au fost bacterii mai puțin rezistente. Cele mai sensibile microorganisme, B. cereus CTC 1, Ent. faecalis ATCC 19433 și Lb. helveticus (Wiesby) au prezentat cele mai mari sensibilități față de unii dintre producători. Dintre producători, tulpinile CTC 210 și CTC 404 au prezentat valori mai mici ale activității de inhibiție, în timp ce tulpinile CTC 469, CTC 483 și CTC 485 au prezentat cea mai mare activitate. Dintre tulpinile testate, CTC 164 și CTC 469 au prezentat cele mai largi spectre de activitate, deoarece au fost capabile să inhibe 44,4 % din culturile indicatoare.
Câteva dintre microorganismele care au prezentat sensibilitate față de tulpinile testate cu ajutorul testului de bună difuzie, cum ar fi speciile Gram-negative (E. coli ATCC 25422, Pseudomonas sp. CTC 32 și Salm. typhimurium ATCC 14028), Cl. sporogenes CTC 6, Micrococcus sp. ATCC 4698, Lb. plantarum TECNOLAT 434 și Streptococcus sp. ATCC 25175, nu au fost inhibate în testul Mayr-Harting et al. (19). Numai B. cereus CTC 1 a prezentat același model de sensibilitate atunci când a fost analizat prin ambele metode.
Inhibiția culturilor indicatoare a fost mai mare folosind testul de difuzie bine. Deoarece atât culturile producătoare, cât și indicatorii au crescut în același timp, inhibiția ar putea fi cauzată de o competiție pentru nutrienții din mediile de cultură. Utilizarea supernatanților fără celule în testul Mayr-Harting et al. (19) ar putea evita această problemă.
Sensibilitatea la enzimele proteolitice și lipolitice
Sensibilitatea substanțelor antibacteriene produse de bacteriile lactice la a-chimotripsină, tripsină, pronază E, ficină, pepsină, papaină și lipază a fost determinată în condiții controlate și reproductibile prezentate în (tabelul 4). Toți compușii au fost inactivate total sau parțial de unele dintre enzimele proteolitice, ceea ce indică natura lor proteică.
În general, compușii inhibitori produși de aceste tulpini au prezentat diferite modele de sensibilitate. Toate au fost complet inactivate de a-chimotripsină, pronază E și ficină. Doar una a fost rezistentă la tripsină (tulpina CTC 141), în timp ce substanța produsă de tulpina CTC 204 și-a pierdut 75% din activitate după tratamentul cu această enzimă. Unii autori diferențiază nizina de alte bacteriocine lactococice prin faptul că a-chimotripsina este singura enzimă proteolitică la care nizina este sensibilă (14,22). Cu toate acestea, această proprietate trebuie privită cu prudență, deoarece alți autori au raportat că nizina poate fi inactivată și de alte enzime, cum ar fi pronaza E (15,23) și ficina (5,21).
Pepsina a inhibat activitatea antagonistă a 75% din tulpini (CTC 141, CTC 164, CTC 210, CTC 368, CTC 396, CTC 404, CTC 483, CTC 484 și CTC 485). Sensibilitatea la pepsină a fost demonstrată în cazul altor bacteriocine: plantaricin 35d (20), sakacin A (28) și enterocin 416KI (27). Papaina nu a afectat activitatea substanțelor antibacteriene produse de tulpinile CTC 141 și CTC 404, în timp ce această enzimă le-a inactivat pe celelalte.
Compușii produși de tulpinile CTC 164, CTC 210, CTC 368, CTC 483, CTC 484 și CTC 485, au fost inactivate total sau parțial după tratamentul cu lipază, ceea ce indică faptul că aceste substanțe inhibitoare pot avea o fracțiune lipidică în compoziția lor chimică.
Este interesant de remarcat faptul că compușii produși de aceste tulpini au fost inactivați de o serie de enzime proteolitice, inclusiv de cele de origine pancreatică (tripsină și a-chimotripsină) și de multe ori de origine gastrică (pepsină). Pe baza definiției bacteriocinelor din bacteriile Gram-pozitive dată de Tagg et al. (34) și Klaenhammer (14) și prin utilizarea proprietăților observate la bacteriocinele din bacteriile lactice (22), compușii antibacterieni produși de tulpinile prezente pot fi clasificați ca bacteriocine. Modelul de sensibilitate la protează indică singularitatea bacteriocinelor produse de izolate și faptul că tulpinile sunt diferite. Deși unele dintre bacteriocine au prezentat un model similar de sensibilitate la protează, cum ar fi între CTC 210 și CTC 484 sau între CTC 352 și CTC 469, acestea nu au avut un spectru identic de activitate.
Rezultatele au arătat că 61% din probele de carne analizate au prezentat bacterii lactice producătoare de bacteriocine cu potențial de inhibare a microorganismelor dăunătoare, cum ar fi L. monocytogenes, S. aureus și bacterii sporulate. Activitatea antimicrobiană a bacteriocinelor produse de bacteriile lactice izolate în cadrul acestei cercetări ar putea acționa ca o barieră pentru a inhiba deteriorarea alimentelor și/sau creșterea microorganismelor patogene în alimente. Sunt în curs de desfășurare lucrări suplimentare pentru a evalua natura acestor substanțe și aplicabilitatea lor în tehnicile de bioconservare a cărnii.
RECUNOȘTINȚE
Autorii mulțumesc FAPESP (Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo) pentru sprijinul financiar (Proces 99/12314-0).
1. Benkerroum, N.; Ghouati, Y.; Sandine, W.E.; Tantaoui-Elaraki, A. Methods to demonstrate the bactericidal activity of bacteriocins. Letters Appl. microbiol., 17: 80-81, 1993.
2. Breer, C.; Schopfer, K. Listeria și alimentele. Lancet ii, 1022, 1988.
3. Campanini, M.; Pedrazzoni, I.; Barbuti, S.; Baldini, P. Comportamentul Listeria monocytogenes în timpul maturării salamului contaminat natural și artificial: efectul culturilor starter de bacterii lactice. Int. J. Food Microbiol., 20: 169-175, 1993.
4. Caplice, E.; Fitzgerald, G.F. Food fermentations: role of microorganisms in food production and preservation. Int. J. Food Microbiol., 50(1-2): 131-149, 1999.
5. Carminati, D.; Giraffa, G.; Bossi, M. Bacteriocin-like inhibitors of Streptococcus lactis against Listeria monocytogenes. J. Food Prot., 52(9): 614-617, 1989.
6. Cleveland, J.; Montville, T.J.; Nes, I.F.; Chikindas, M.L. Bacteriocine: antimicrobiene sigure, naturale, pentru conservarea alimentelor. Int. J. Food Microbiol., 71: 1-20, 2001.
7. De Martinis, E.C.P.; Públio, M.R.P.; Santarosa, P.R.; Freitas, F.Z. Antilisterial activity of lactic acid bacteria isolated from vacuum-packed Brazilian meat ant meat products. Braz. J. Microbiol., 32(1): 32-37, 2001.
8. De Vuyst, L.; Vandamme, E. Nisin, un lantibiotic produs de Lactococcus lactis subsp. lactis: proprietăți, biosinteză și aplicații. În: Nisinis: De Vuyst, L.; Vandamme, E. (eds.). Bacteriocins of lactic acid bacteria. Microbiologie, genetică și aplicații. Blackie Academic and Professional, Londra, 1994, p.151-221.
9. Fleming, D.W.; Cochi, S.L.; MacDonald, K.L.; Brondum, J.; Hayes, P.S.; Plikaytis, B.D.; Holmes, M.B.; Audurier, A.; Broomer, C.V.; Reingold, A.L. Laptele pasteurizat ca vehicul de infecție într-un focar de listerioză. N. Engl. J. Med., 312: 404-407, 1985.
10. Harrigan, W.F.; McCance, M.E. Metode de bază. În: M.D: Harrigan, W.F.; McCance, M.E. (eds.). Metode de laborator în microbiologia alimentelor și a produselor lactate. Academic Press, Londra, 1976, p.1-115.
11. Hauben, K.; Wuytack, E.; Soontjens, C.C.F.; Michiels, C.W. Sensibilizarea tranzitorie de înaltă presiune a Escherichia coli la lizozim și nisin prin întreruperea permeabilității membranei externe. J. Food Prot., 59: 350-355, 1996.
12. Hugas, M.; Monfort, J.M. Bacterial starter cultures for meat fermentation. Chimie alimentară, 59(4): 547-554, 1997.
13. Johnson, J.L.; Doyle, M.P.; Cassens, R.G. Listeria monocytogenes and other Listeria spp. in meat and meat products. A review. J. Food Prot., 53(1): 81-91, 1990.
14. Klaenhammer, T.R. Bacteriocine ale bacteriilor lactice. Biochimie, 70: 337-349, 1988.
15. Kojic, M.; Svircevic, J.; Banina, A.; Topisirovic, L. Tulpina producătoare de bacteriocine din Lactococcus lactis subsp. diacitilactis S50. Appl. Environ. Microbiol. 57(6): 1835-1837, 1991.
16. Lewus, C.B.; Kaiser, A.; Montville, T.J. Inhibarea agenților patogeni de origine alimentară de către bacteriocine din bacteriile lactice izolate din carne. Appl. Environ. Microbiol. 57(6): 1683-1688, 1991.
17. Linnan, M.J.; Mascola, L.; Lou, X.D.; Goulet, V.; May, S.; Salminen, C.; Hird, D.W.; Yonekura, M.L.; Hayes, P.; Weaver, R.; Audurier, A.; Plikaytis, B.D.; Fannin, S.L.; Kleks, A.; Broome, C.V. Listerioză epidemică asociată cu brânza de tip mexican. N. Engl. J. Med., 319: 823-828, 1988.
18. Lücke, F-K. Utilizarea microbilor pentru prelucrarea și conservarea cărnii. Meat Sci., 56: 105-115, 2000.
19. Mayr-Harting, A.; Hedges, A.J.; Berkeley, C.W. Methods for studying bacteriocins. În: In: Norris, J.R.; Ribbons, D.W. (eds.). Methods in Microbiology. Academic Press Inc., New York, 1972, p.316-422.
20. Messi, P.; Bondi, M.; Sabia, C.; Battini, R.; Manicardi, G. Detectarea și caracterizarea preliminară a unei bacteriocine (plantaricină 35d) produsă de o tulpină de Lactobacillus plantarum. Int. J. Food Microbiol., 64: 193-198, 2001.
21. Moreno, I.; Lerayer, A.L.S.; Baldini, V.L.S.; Leitão, M.F.F. Characterization of bacteriocins produced by Lactococcus lactis strains. Braz. J. Microbiol., 31(3): 184-192, 2000.
22. Piard, J.C.; Desmazeaud, M. Inhibition factors produced by lactic acid bacteria. 2. Bacteriocine și alte substanțe antibacteriene. Lait, 72: 113-142, 1992.
23. Rammelsberg, M.; Radler, F. Antibacterial polypeptides of Lactobacillus species. J. Appl. Bacteriol., 69: 177-184, 1990.
24. Rayman, K.; Malik, N.; Hurst, A. Eșecul nizinei de a inhiba proliferarea Clostridium botulinum într-un sistem model de carne maturată. Appl. Environ. Microbiol. 46: 1450-1452, 1983.
25. Roberts, D. Bacterii de importanță pentru sănătatea publică. În: Bacteriile: Brown, M.H. (ed.) Microbiologia cărnii. Applied Science Publishers Ltd., Londra, 1982, p.319-386.
26. Rose, N.L.; Sporns, P.; Stiles, M.E.; McMullen, L.M. Inactivarea nisinului de către glutation în carnea proaspătă. J. Food Sci., 64(5): 759-762, 1999.
27. Sabia, C.; Manicardi, G.; Messi, P.; Niederhäusern, S.; Bondi, M. Enterocin 416K1, o bacteriocină antilisteriană produsă de Enterococcus casseliflavus IM 416K1 izolat din cârnați italieni. Int. J. Food Microbiol., 75: 163-170, 2002.
28. Schillinger, U.; Lücke, F-K. Activitatea antibacteriană a Lactobacillus sake izolat din carne. Appl. Environ. Microbiol. 55(8): 1901-1906, 1989.
29. Schlech, W.F.; Lavigne, P.M.; Bortolussi, R.A.; Allen, A.C.; Haldane, E.V.; Wort, A.J.; Hightower, A.W.; Johnson, S.E.; King, S.H.; Nicholls, E.S.; Broome, C.V. Epidemic listeriosis-evidence for transmission by food. N. Eng. J. Med., 308: 203-204, 1983.
30. Schved, F.; Henis, Y.; Juven, B.J. Răspunsul sferoplastelor și al celulelor permeabilizate cu chelator ale bacteriilor Gram-negative la acțiunea bacteriocinei pediocină SJ-1 și a nizinei. Int. J. Food Microbiol. 21: 305-314, 1994.
31. Shahidi, F. Developing alternative meat-curing systems. Trends Food Sci. Technol. 2: 219-222, 1991.
32. Stevens, K.A.; Sheldon, B.W.; Klapes, N.A.; Klaenhammer, T.R. Nisin treatment for inactivation of Salmonella species and other Gram-negative bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 57: 3613-3615, 1991.
33. Stiles, M.E.; Hastings, J.W. Bacteriocin production by lactic acid bacteria: Potențial de utilizare în conservarea cărnii. Trends Food Sci. Technol. 2: 247-251, 1991.
34. Tagg, J.R.; Dajani, A.S.; Wannamaker, L.W. Bacteriocine ale bacteriilor gram-pozitive. Bacteriol. Rev., 40: 722-756, 1976.
35. Tagg, J.R.; McGiven, A.R. Sistem de testare pentru bacteriocine. Appl. microbiol. 21(5): 943, 1971.
36. Varnam, A.H.; Sutherland, J. Salamuri fierte. În: A: Varnam, A.H.; Sutherland, J.P. (eds.). Carne și produse din carne. Tehnologie, chimie și microbiologie. Chapman & Hall, Londra, 1995, p.298-313.
37. Yang, R.; Ray, B. Prevalența și controlul biologic al leuconostocurilor psihotrofe producătoare de bacteriocine asociate cu deteriorarea cărnii procesate ambalate în vid. J. Food Prot., 57(3): 209-217, 1994.
38. Yousef, A.E.; Luchansky, J.B.; Degnan, A.K.; Doyle, M.P. Behaviour of Listeria monocytogenes in Wiener exsudate in the presence of Pediococcus acidilactici H or pediocin AcH during storage at 4 or 25ºC. Appl. Environ. Microbiol. 57: 1461-1467, 1991.
39. Grupul de lucru informal al Organizației Mondiale a Sănătății privind listerioza de origine alimentară. Listerioza de origine alimentară. Document nr. WHO/WHE/FOS/88.5. Organizația Mondială a Sănătății: Geneva, Elveția, 1988.