O Chimeră a fost o creatură din mitologia greacă reprezentată de obicei ca o combinație între un leu, o capră și un șarpe. Utilizarea contemporană a termenului „chimerism” în transplantul de celule hematopoietice derivă din această idee de entitate „mixtă”, referindu-se la o persoană care a primit un transplant de țesut diferit din punct de vedere genetic. Un test pentru chimerism după un transplant de celule stem hematopoietice implică identificarea profilurilor genetice ale primitorului și ale donatorului și apoi evaluarea gradului de amestec în sângele, măduva osoasă sau alte țesuturi ale primitorului.
Testarea chimerismului (analiza grefei) prin ADN utilizează metodologia folosită în mod obișnuit în testarea identității umane și se realizează prin analiza polimorfismelor genomice numite loci STR (short tandem repeat). Acești loci constau dintr-o secvență centrală de ADN care se repetă de un număr variabil de ori în cadrul unui locus genetic discret. Termenul STR, denumit, de asemenea, microsateliți, se referă la numărul de perechi de baze ale unei secvențe centrale de ADN repetate în tandem, a cărei lungime variază între 2 și 8 perechi de baze. Acești loci prezintă alele care pot diferi în lungime între indivizi și sunt moștenite ca trăsături mendeliene codominante. Loci STR au fost identificați în tot genomul uman, iar unii loci au mai mult de 25 de alele.
Informațiile privind secvența de ADN din regiunile laterale conservate ale locilor sunt utilizate pentru a crea perechi de amorsă oligonucleotidă pentru STR-uri. Acești primeri sunt utilizați în amplificarea PCR (reacție în lanț a polimerazei) a probelor de test. Această tehnică poate amplifica secvența STR de până la un miliard de ori, furnizând material care poate fi separat cu ajutorul unui gel electroforetic sau prin electroforeză capilară (CE). Genotiparea se face prin evaluarea dimensiunilor fragmentelor de ADN. Referința la o scară alelică poate fi utilizată pentru identificarea exactă a alelelor STR.
Sistemul STR/CE bazat pe PCR are mai multe avantaje față de alte metode de analiză. Amplificarea mai multor loci STR poate fi combinată (multiplexată) într-un singur tub, permițând analiza a până la șaisprezece loci într-o singură reacție. Deoarece sunt necesare cantități infime de ADN, pot fi utilizate probe cu un număr redus de celule, iar dimensiunea mică a alelelor STR face posibilă chiar și utilizarea probelor de ADN degradat. Datele digitale facilitează analiza și arhivarea, iar procesul CE este atât rapid, cât și eficient din punct de vedere al costurilor. Amplificarea PCR și analiza lociilor STR oferă o metodă rapidă și fiabilă pentru evaluarea stării de grefare în cadrul transplantului de celule stem.
Tehnologia utilizată în prezent permite coamplificarea și detectarea în trei culori a șaisprezece loci care sunt subdivizați în 3 seturi de 5 sau 6 loci care prezintă fragmente amplificate cu intervale de dimensiuni care nu se suprapun.
În timpul etapei de amplificare PCR, fragmentele amplificate sunt marcate cu coloranți fluorescenți. După amplificarea PCR, probele sunt procesate pe un sistem de electroforeză capilară (CE).
Analiza datelor este facilitată de un software de analiză a fragmentelor, care dimensionează fragmentele de ADN folosind un standard de bandă internă rulat cu proba și atribuie genotipurile prin comparație cu o scară de alele STR inclusă în rularea CE. Acest lucru oferă profiluri genotipice STR distincte pentru donator și pentru beneficiarul transplantului. Loci STR care sunt polimorfici (adică informativi) între aceste persoane sunt utilizați pentru a evalua cantitățile relative de ADN al primitorului și al donatorului în proba post-transplant.
Eșantioanele testate pot proveni din orice material care conține ADN, inclusiv măduvă osoasă, sânge periferic, tumori solide, țesut epidermic, foliculii de păr, tampoane bucale și subseturi de celule fracționate. Deoarece amplificarea PCR a unei probe se realizează în mod obișnuit cu mai puțin de 2 ng de ADN genomic (echivalentul a aproximativ 300 de celule), testarea chimerismului prin această metodă poate fi realizată cu succes chiar și în cazul pacienților cu eșec al grefei, leucopenie severă sau din fracțiuni de subseturi de celule hematopoietice. Analiza STR a fost utilizată pentru a evalua starea de grefare a pacienților care au primit un transplant de celule hematopoietice, inclusiv a pacienților care au primit unități duble de donator de sânge din cordonul ombilical sau un al doilea transplant de la un alt donator; precum și pentru a confirma identitatea genetică a gemenilor identici putativi și pentru a detecta grefa de celule materne derivate in-utero în rândul pacienților cu diagnosticul de imunodeficiență combinată severă (SCID). Analiza STR/CE este o procedură rapidă, fiabilă, precisă și reproductibilă.
Limitații ale testului
- Din probele de test trebuie izolat suficient ADN pentru a permite o amplificare PCR robustă. Metodele de izolare a ADN-ului trebuie să fie disponibile pentru a trata eșantioane cu număr scăzut de celule, cum ar fi cele care ar putea fi întâlnite la primitorii cu insuficiență de grefă și din subseturile de celule albe din sânge sortate în funcție de linia sanguină prin citometrie de flux. Probele pot avea concentrații prea mici pentru a fi cuantificate prin spectrofotometrie UV OD260. Probele de ADN de la 5 000 până la 30 000 de celule izolate asigură în mod fiabil o amplificare acceptabilă. Laboratorul are linii directoare care definesc când trebuie repetată analiza probei.
- Cu kiturile comerciale, mulți loci STR au alele informative atât pentru donator, cât și pentru primitor în cadrul donatorilor neînrudiți. Cu toate acestea, numărul de loci STR informativi poate fi limitat la doar 3 în cazul perechilor de transplant cu donator înrudit. S-a constatat că valorile cantitative care reprezintă media a doar 3 loci STR sunt reproductibile.
- Pacienții cu boli maligne pot avea mutații clonale care au impact asupra anumitor loci STR. O alelă a pacientului poate fi absentă la unul sau mai mulți loci STR atunci când se compară alelele identificate în eșantionul pacientului pre-transplant față de eșantionul post-transplant. În circumstanțe rare, o alelă STR suplimentară a pacientului poate fi detectată la un anumit locus care nu era prezent în eșantionul pretransplant. În majoritatea cazurilor, aceste anomalii se datorează probabil unor translocații cromozomiale. Alelele lipsă ar putea fi, de asemenea, rezultatul unei mutații în cadrul secvențelor flancate conservate STR în care sunt localizați primerii PCR. Datele de la loci STR cu alele lipsă sau în plus nu sunt utilizate pentru cuantificare.
- Dacă nu sunt disponibile celule pre-transplant ale pacientului, pot fi colectate probe precum tampoane bucale, biopsii cutanate sau rădăcini de păr după transplant. Cu toate acestea, trebuie remarcat faptul că probele bucale pot conține cantități semnificative de celule de la donator.
- Testul nu este destinat detectării bolii reziduale minime.
Indicații clinice pentru testarea chimismului în transplantul de celule hematopoietice
Documentarea post-transplant de rutină a originii donator/receptor a globulelor albe din sângele periferic și/sau măduva. Documentarea grefei poate include testarea subseturilor de celule specifice liniei, cum ar fi celulele T CD3 pozitive și celulele mieloide CD33 pozitive.
Evaluați celulele donatorului/receptorului la pacienții cu funcție medulară inadecvată.
Definiți dacă tumorile maligne recurente sau noi au provenit de la celulele receptorului sau ale donatorului.
Evaluați riscurile prognostice de respingere și de tumori maligne recurente.
Documentați persistența celulelor donatorului după transplant la pacienții cu boală recurentă sau înainte de infuzia de limfocite ale donatorului (DLI).
Evaluați dacă a avut loc respingerea grefei la primitorii care sunt candidați pentru un al doilea transplant.
Diferențiați originea celulelor donatorului la primitorii care au primit un al doilea transplant cu un donator diferit sau un transplant cu unități duble de sânge din cordonul ombilical.
Detectați prezența celulelor de origine maternă la pacienții diagnosticați cu imunodeficiență combinată severă (SCID).
Verificați identitatea genetică a gemenilor identici putativi.
Întrebări frecvente
Întrebare: Cum sunt analizați donatorii multipli?
Răspuns: Este esențial să se identifice loci STR care prezintă cel puțin o alelă STR unică pentru pacient și pentru fiecare donator.
Întrebare: De ce se testează grefa maternă?
Răspuns: Este posibil ca pacienții diagnosticați cu o imunodeficiență combinată severă (SCID) să se fi grefat cu celule hematopoietice de origine maternă in-utero. Anumite subseturi de celule specifice liniei (în special celulele CD3-pozitive) pot fi predominant sau în întregime de origine maternă.
Întrebare: Care este diferența dintre chimerismul „complet” și cel „mixt”?
Răspuns: Chimerismul „complet” este utilizat pentru a se referi la un pacient care prezintă un fenotip post-transplant în celulele hematopoietice care este în totalitate de origine donator.
Cimerismul „mixt” se referă la un pacient care prezintă un amestec de fenotip de pacient și donator în celulele hematopoietice după transplant.
Întrebare: Ce se întâmplă dacă nu este disponibilă o probă de bază a primitorului?
Răspuns: Sunt disponibile mai multe opțiuni pentru obținerea unei probe de primitor după transplant: pentru o probă de bază a primitorului se pot utiliza probe de ștergere bucală, de rădăcină de păr sau de biopsie cutanată. Probele de ștergere bucală trebuie utilizate cu precauție, deoarece celulele donatorului pot fi prezente în cantități semnificative în probele bucale.
Întrebare: Ce se întâmplă dacă nu este disponibilă o probă de bază a donatorului?
Răspuns: Dacă donatorul este în viață, obțineți o nouă probă de sânge. Dacă donatorul nu este în viață, probele post-transplant trebuie comparate cu probele de bază pre-transplant ale pacientului pentru a identifica alelele STR care sunt detectate, dar care nu sunt de origine pacient.
Întrebare: De ce nu este HLA un mijloc fezabil de monitorizare a grefei?
Răspuns: Donatorii de transplant sunt aleși pentru a fi cât mai apropiați posibil de primitor. Nu există markeri HLA care să diferențieze receptorul și donatorul atunci când sunt compatibili, și doar unul sau doi dacă sunt nepotriviți. În plus, alte tehnologii sunt adesea mai sensibile în acest scop decât monitorizarea alelelor HLA nepotrivite; în consecință, sunt utilizați alți loci pentru a furniza profiluri unice.
Întrebare: Ce este o întrebare? Ce este un locus STR informativ?
Răspuns: Acesta este un locus cu cel puțin o alelă unică pentru primitor sau donator. Pentru a fi util pentru calculele de chimerism, un locus trebuie să aibă alele unice pentru ambii. Poate exista un număr mare de loci informativi atunci când pentru transplant se folosește un donator neînrudit, dar foarte puțini dacă se folosește un frate sau o soră compatibilă. Din cauza diferențelor în eficiența de amplificare a alelelor de la fiecare locus, este preferabil să se obțină valori medii sau mediane de la mai mulți loci pentru a spori precizia. Rezultatele de la loci individuali sunt reproductibile în mod fiabil, astfel încât chiar și un singur locus poate fi utilizat pentru tendința probelor secvențiale.
Întrebare: Ce este locusul „amelogenin” care este inclus în unele panouri de amplificare?
Răspuns: Gena amelogenin este localizată pe cromozomii X și Y. Nu este un STR, dar prezintă dimensiuni diferite ale produselor pe cromozomii respectivi. Acest lucru o face utilă pentru determinarea sexului. Este inclusă în panoul de amorsă de către vânzătorii de kituri comerciale care vizează comunitatea criminalistică, unde diferențierea X/Y este utilizată pe scară largă. În general, nu este utilizat pentru analiza chimerismului, deoarece nu poate furniza un marker feminin unic (o probă masculină include întotdeauna o alelă X); de asemenea, nu este utilă nici la evaluarea probelor după un transplant de celule stem de sex corespunzător.
Întrebare: Prin ce se deosebește analiza chimerismului STR de genotipare?
Răspuns: „Genotipul” se referă la alelele particulare prezente într-un locus specificat. Genotiparea se face pentru a stabili profilurile destinatarului și donatorului în testarea chimerismului. Atunci când analiza chimerismului se face după un transplant de celule stem, profilurile genotipice ale receptorului și ale donatorului sunt comparate cu profilul probei post-transplant pentru a evalua cât de mult din fiecare componentă este prezentă.
Genotiparea este, de asemenea, utilizată în alte scenarii, cum ar fi criminalistica și testarea filiației. Analiștii criminaliști folosesc genotipurile pentru a identifica sursa dovezilor în cazurile penale și pentru a exclude persoane de la luarea în considerare ca suspecți. De asemenea, aceștia pot identifica rămășițele umane în cazurile „John Doe” și în cazul dezastrelor în masă. Determinarea filiației se face într-un mod similar pentru a exclude pe cineva ca posibil părinte prin găsirea unor alele prezente la copil care nu se potrivesc nici cu mama, nici cu tatăl presupus.
Literatură citată/lectură recomandată
Bryant E, Martin PJ. Documentarea grefării și caracterizarea chimerismului în urma transplantului de celule hematopoietice. În: In: Forman S, Blune K, Thomas ED, eds. Transplantul de celule hematopoietice. Ediția a 2-a. Malden, MA: Blackwell Science, 1998.
Bultler J. Forensic DNA typing. Elsevier Academic Press.
.