TEXT
Virozele gripale umane infectează, de obicei, sistemul respirator superior, provocând strănut, scurgeri nazale și tuse, precum și febră, stare de rău și artralgie (22). În plus, au fost raportate, de asemenea, complicații neurologice atunci când un nou subtip de virus gripal este introdus în populația umană, așa cum au exemplificat pandemiile spaniole (1918) și asiatice (1957) (2-4, 6, 10, 18, 22).
În 1997, virusul gripal H5N1, care provine de la păsările de curte, a provocat un focar la om. De atunci, mai mult de 500 de persoane au fost infectate cu virusul H5N1 în întreaga lume, cu o rată de mortalitate de aproximativ 60% (21). Infecția cu virusul H5N1 la om se manifestă, în general, prin pneumonie severă, care evoluează spre sindromul de detresă respiratorie acută; cu toate acestea, unele victime ale virusului H5N1 au prezentat afectare neurologică (1). ARN-ul și antigenii virusului H5N1 au fost detectați în creierul pacienților, iar virusul însuși a fost izolat din lichidul cefalorahidian (5, 7) Aceste date sugerează că unele virusuri H5N1 ar putea provoca encefalită la om, așa cum s-a întâmplat în fazele timpurii ale pandemiilor din Spania și Asia.
Feretele reprezintă un model mamifer util de infecție gripală, deoarece sunt foarte sensibile la infecția cu virusuri gripale și dezvoltă unele dintre simptomele gripei care sunt observate la om (8, 12, 14, 16, 19). Neuroinvazivitatea virusului gripal H5N1 în urma unei expuneri intranazale a fost, de asemenea, raportată la un model de dihor (23). Prin urmare, pentru a studia efectele neurologice pe termen lung ale infecției cu virusul H5N1, am infectat dihorii cu viruși H5N1 care provoacă simptome ușoare la aceste animale și am observat efectele asupra sistemului nervos central (SNC) timp de 9 luni. Am căutat, de asemenea, să elucidăm calea prin care aceste virusuri H5N1 au invadat SNC.
Furnicile de șase luni au fost inoculate intranazal cu 106 PFU de virus A/Hong Kong/483/1997 (H5N1; HK483) sau A/Hong Kong/486/1997 (H5N1; HK486). Aceste virusuri au fost propagate în celule de rinichi canin Madin-Darby (MDCK) în mediu minim esențial suplimentat cu 0,3% seroalbumină bovină. În zilele 3, 6 și 12 și în lunile 1, 3, 6 și 9 postinfecție (p.i.), am prelevat probe de țesut pentru izolarea virusului și examinarea patologică. Dihorii au fost letargici și au prezentat semne și simptome de infecție respiratorie în primele 10 zile p.i., dar nu au prezentat semne neurologice apreciabile, ceea ce este în contrast cu rezultatele raportate anterior (23). S-au recoltat eșantioane de țesut din turbinatele nazale, plămâni, trahee, creier, ficat, splină, rinichi, inimă, pancreas și măduva spinării și s-au omogenizat până la o suspensie de 10 % cu soluție salină tamponată cu fosfat. Titrul virusului în fiecare țesut a fost determinat cu ajutorul testelor în plăci. Virușii s-au replicat în principal în cornetele nazale, titlurile de virus atingând 105 până la 106 PFU/gram de țesut la 3 până la 6 zile p.i. (tabelul 1). Țesuturile cerebrale prelevate de la dihorii infectați cu HK483 sau HK486 au fost conservate în formalină tamponată neutră 10% și prelucrate pentru includerea în parafină. Țesuturile încorporate în parafină au fost tăiate în felii de 5 mm grosime și colorate cu hematoxilină și eozină (H&E). Secțiuni suplimentare au fost tăiate pentru colorarea imunohistologică cu anticorpi policlonali de iepure împotriva unui virus gripal H5. Examinarea histologică a evidențiat invazie sau leziuni neuronale, inclusiv inflamație a plexului coroidian (tabelul 2). Dihorii infectați cu virusul HK486 au prezentat dovezi de inflamație nesupurativă (Fig. 1a) și de expresie a antigenului viral (Fig. 1b) care au persistat timp de 12 zile; antigenii virali nu au fost detectați la 1 lună p.i. Encefalita nesupurativă a durat 3 luni (Fig. 1c), cu cicatrici gliale reziduale evidente la 6 și 9 luni p.i. în zonele în care au fost detectați antigeni virali în faza anterioară (Fig. 1d). Mai mult, dihorii infectați cu HK486 au prezentat leziuni macroscopice ale sistemului olfactiv în ziua 12 p.i. (Fig. 1e și f). Aceste constatări sugerează că, deși virușii H5N1 înalt patogeni afectează în principal căile respiratorii ale gazdei (1), aceștia pot produce, de asemenea, complicații neurologice. Spre deosebire de virusul HK486, care a invadat parenchimul cerebral al dihorilor și a produs leziuni parenchimatoase grave, cea de-a doua tulpină H5N1, HK483, a provocat o vasculită severă nesupurativă fără leziuni parenchimatoase aparente în creierul dihorilor la 6 zile p.i. Deși antigenul viral nu a putut fi detectat în vasculatură, leziunile vasculare au fost evidente, caracterizate prin umflături endoteliale (Fig. 2a, vârfuri de săgeată), celule apoptotice dispersate (Fig. 2b, vârfuri de săgeată) și infiltrare intramurală de macrofage (Fig. 2a, săgeți) și leucocite polimorfonucleare (Fig. 2b, săgeată). Leziuni vasculare au fost găsite la nivelul talamusului, la joncțiunea dintre substanța cenușie și cea albă și la nivelul trunchiului cerebral. Specimenele de creier examinate la 1 și 6 luni p.i. prezentau leziuni hemoragice care indicau hemoragii perivasculare cronice și repetate (Fig. 2c) în talamus, cerebel și în spațiul subarahnoidian al creierului anterior (Fig. 2d). Aceste observații sunt în concordanță cu rapoartele privind complicațiile hemoragice cerebrale induse de virusul gripal în timpul epidemiilor anuale (11). Vasculita cerebrală secundară infecției virale este relativ frecventă (17) și este probabil cauza fragilității peretelui vascular, ceea ce duce la hemoragie cerebrală. Prin urmare, pare rezonabil să se concluzioneze că infecția cu virusul H5N1 la om poate provoca hemoragii cerebrale similare cu cele observate la infecția cu alte virusuri neurotrope.
- Vezi în linie
- Vezi popup
Recuperarea virusului din țesuturile dihorilor infectați cu virusul H5N1 HK483 sau HK486
- Vezi în linie
- Vezi popup
Prevalența leziunilor cerebrale la dihor la diferite momente de timp postinfecție cu virusuri gripale H5N1 înalt patogenea
Lesiuni cerebrale la dihorii infectați cu virusul HK486. (a) Encefalită severă nesupurativă în zona olfactivă în ziua 6 postinfecție (p.i.). (b) Expresia antigenului viral într-o leziune cerebrală în ziua 12 p.i. Celulele neuronale și gliale sunt colorate cu antiserul virusului anti-H5. (Inset) Neuronii și glia neinfectate. (c) Encefalită în țesutul cerebral la 3 luni p.i. (d) Formarea unei cicatrici gliale perivasculare la 9 luni p.i. (e) Leziune cerebrală vizibilă macroscopic într-o parte a sistemului olfactiv (lobul piriform) în ziua 12 p.i. (f) Pierderea parțială a unui bulb olfactiv (partea superioară a creierului ) din cauza encefalitei virale la 1 lună p.i. Comparați aceste imagini cu creierul unui martor corespunzător vârstei (partea inferioară a creierului).
Lesiuni cerebrale la dihorii infectați cu virusul HK483. (a) Vasculită proeminentă nesupurativă în ziua 6 p.i. Observați umflarea severă a unei celule endoteliale vasculare (vârfuri de săgeată) și migrarea macrofagelor în peretele vascular (săgeți), în comparație cu aspectul normal al parenchimului cerebral înconjurător. (b) Celule apoptotice împrăștiate (vârfuri de săgeată) și leucocite polimorfonucleare (săgeată) în peretele vascular în ziua 6 p.i. (c) Leziuni hemoragice vechi și proaspete în talamusul unui dihor care a fost supus necropsiei la 6 luni p.i. (vârfuri de săgeată, macrofage încărcate cu hemosiderină într-o leziune veche; săgeți, hemoragie proaspătă cu globule roșii). (d) Hemoragie subarahnoidiană proaspătă în creierul unui dihor la 6 luni p.i. Observați acumularea de globule roșii între leptomeningele (linie neagră punctată) și arahnoidul mater (linie roșie punctată).
Pentru a examina calea prin care virusurile H5N1 invadează creierul dihorilor, am analizat distribuția leziunilor cerebrale și expresia antigenului viral observate la dihorii infectați cu virusurile HK483, HK486, A/Hong Kong/213/2003 (HK213), A/Vietnam/1204/2004 (VN1204) și A/duck/Vietnam/NCVD-18/2004 (NCVD18). Virusurile HK213, VN1204 și NCVD18 au fost propagate în celule MDCK în mediu minim esențial suplimentat cu 0,3% seroalbumină bovină. Dihorii în vârstă de șase luni au fost inoculați intranazal cu 106 PFU de virus. Țesuturile cerebrale au fost prelevate în faza acută, la 3 și 6 zile postinfecție pentru VN1204 și NCVD18 și, în plus, la 12 zile postinfecție pentru HK213. Țesuturile au fost prelucrate pentru colorarea H&E și imunohistochimie pentru examinare histologică. Leziunile parenchimatoase cerebrale produse de VN1204, NCVD18 și HK213 au fost caracterizate de encefalită nesupurativă, iar modelul de expresie a antigenelor virale a fost, în esență, același cu cel al HK486 (datele nu sunt prezentate). Pentru a înțelege distribuția tridimensională (3D) a leziunilor cerebrale și a antigenelor virale, le-am trasat prin imagistică 3D (TRI/3D-SRF2; Ratoc System Engineering Co., Ltd., Japonia) a unui creier de mangustă galbenă (Cynictis penicillata), a cărui arhitectură seamănă foarte mult cu cea a creierului de dihor (20). Pentru a vizualiza calea olfactivă (adică calea senzorială pentru simțul olfactiv), am marcat căile nervoase de la bulbul olfactiv la cortexul piriform pe imaginile 3D ca un cadru de referință (Fig. 3a, galben; a se vedea, de asemenea, filmul S1 în materialul suplimentar). Am găsit trei modele distincte de leziuni cerebrale, cu și fără antigene virale, cauzate de diferitele virusuri gripale H5N1: cele distribuite doar de-a lungul căii olfactive (Fig. 3b și c, linie galbenă punctată; a se vedea, de asemenea, Filmele S2 și S3) (HK213 și NCVD18); cele detectate de-a lungul căii olfactive (Fig. 3d și e, linie galbenă punctată; a se vedea, de asemenea, filmele S4 și S5) și în trunchiul cerebral (Fig. 3d și e, săgeți albe; a se vedea, de asemenea, filmele S4 și S5) (HK486 și VN1204); și cele din alte zone (Fig. 3f; a se vedea, de asemenea, filmul S6) (HK483). Baza pentru separarea celui de-al treilea grup de leziuni de celelalte două grupuri este mai evidentă atunci când distribuțiile leziunilor sunt examinate dinspre partea posterioară (Fig. 3g și h, galben versus albastru versus roșu). Aceste rezultate de cartografiere indică faptul că majoritatea tulpinilor H5N1 pe care le-am testat au invadat creierul prin intermediul căii olfactive (Fig. 3, linia galbenă punctată). O excepție a fost tulpina HK483 (Fig. 3f), care a vizat în mod clar vasculatura cerebrală la dihor, producând leziuni în afara sistemului olfactiv.
Distribuția leziunilor cerebrale în urma infecției cu tulpina HK483, HK486, HK213, NCVD18 sau VN1204 a virusului H5N1. Leziunile cerebrale sunt cartografiate pe imagini tridimensionale ale unui creier de mangustă galbenă. Au fost analizate părți selectate din secțiuni ale creierului; prin urmare, graficele cu localizarea leziunilor sunt discontinue. (a) Traseul olfactiv (galben). Distribuția leziunilor și a antigenelor virale (roșu) asociate cu infecția HK213 (b) sau NCVD18 (c) urmează ruta olfactivă (linie galbenă punctată). La animalele infectate cu HK486 (d) sau VN1204 (e), leziunile și antigenele virale sunt localizate în trunchiul cerebral (săgeți albe) și pe calea olfactivă (parcele roșii în interiorul liniei galbene punctate). Tulpina HK483 (f) a provocat leziuni grave ale vaselor de sânge, cu leziuni hemoragice aparente (diagrame albastre). (g) Vedere posterioară a traseului olfactiv (diagrame galbene). (h) Vedere posterioară a leziunilor hemoragice induse de HK483 (albastru) și a vasculitei (roșu) în afara traseului olfactiv. Panourile de la a la f sunt vederi ventrale.
Până când virusurile H5N1 pot deveni pandemice, acestea vor trebui probabil să dobândească capacitatea de a se dezvolta bine în porțiunea superioară a căilor respiratorii umane, ceea ce ar duce la o transmitere eficientă de la om la om prin strănut și tuse (13, 22). Datele noastre de la dihori sugerează că, în cazul în care virusurile H5N1 înalt patogene dobândesc acest punct de sprijin la om, acestea ar putea provoca complicații neurologice subclinice prin invadarea creierului pe căile nervoase sau prin provocarea de vasculită cerebrală. Anterior, un virus H3N2 a fost detectat în creierele de dihor; cu toate acestea, cantitatea de virus din creier a fost scăzută (mai puțin de 102,2 log10 50% doze infecțioase de ouă) și nu a fost raportată nicio dovadă a prezenței antigenelor virale în creier (23). Am constatat că virusul pandemic H1N1 din 2009 s-a replicat mai eficient în tractul respirator al dihorilor decât un virus H1N1 sezonier uman (9, 13, 15) și a provocat leziuni nesupurative ale bulbului olfactiv; cu toate acestea, nu am găsit virusul în parenchimul cerebral al acestor animale (datele nu sunt prezentate). Prin urmare, invazia parenchimului cerebral, demonstrată prin prezența antigenelor virale, este o caracteristică a virusurilor H5N1. Prin urmare, ar fi pertinent să se efectueze studii retrospective și prospective pentru complicații neurologice subclinice la pacienții infectați cu virusul H5N1. Constatările noastre trezesc îngrijorarea că complicațiile neurologice subclinice ar putea însoți infecțiile respiratorii severe la răspândirea la nivel mondial a virusurilor H5N1.
.