Abordări non-organice
Până în prezent, liniile celulare epiteliale intestinale au fost principalele sisteme de modele in vitro pentru a evalua procesele de transport intestinal, în timp ce liniile celulare enteroendocrine sunt modele comune pentru a studia secreția diferiților hormoni intestinali. Un model stabilit pentru enterocitele intestinale mici este linia celulară CaCo-2 (sau subclona CaCo-2 TC7), derivată dintr-un adenocarcinom de colon. Această linie celulară este cultivată în mod obișnuit pe plăci transwell până la 3 sau 4 săptămâni postconfluență pentru studii privind transportul intestinal de nutrienți, medicamente sau alți compuși folosind substraturi marcate prin radio sau fluorescență (Farrell et al., 2013; Ganapathy et al., 1995; Wang și Li, 2017). Celulele HT-29 (și subclonele) sunt o linie celulară de carcinom de colon uman bine stabilită pentru cercetarea transportatorilor intestinali, în special a transportatorilor de zahăr (Delezay și colab., 1995; Liu și colab., 2016). Cu toate acestea, pentru a studia rolul transportatorilor în detectarea nutrienților intestinali, sunt necesare alte linii celulare. Cele mai importante linii celulare enteroendocrine utilizate pentru studii privind secreția de hormoni intestinali sunt linia celulară murină GLUTag (Emery et al., 2015), linia celulară murină STC-1 (Jiang et al., 2016) și linia celulară umană NCI-H716 (Pais et al., 2014). Cu toate acestea, niciuna dintre ele nu reflectă biologia complexă a celulelor enteroendocrine in vivo (Kuhre et al., 2016). Celulele enteroendocrine sunt distribuite în tot intestinul subțire și gros, iar modelele lor de exprimare a diferiților hormoni intestinali diferă foarte mult, în funcție de localizarea lor în tractul intestinal (Habib et al., 2012). De exemplu, numărul de celule care secretă GLP-1 (adesea denumite celule L) crește treptat de la intestinul proximal la cel distal, însă celulele care secretă GIP (denumite celule K) scad. Astfel, liniile celulare enteroendocrine, care sunt toate derivate din tumori, reprezintă sisteme model foarte simple și artificiale pentru investigarea detecției nutrienților, a secreției hormonale intestinale și a mecanismelor moleculare și de reglementare care stau la baza acestora. Avantajul liniilor celulare de mamifere este că acestea sunt bine stabilite de numeroase laboratoare din întreaga lume. Există o mulțime de date științifice disponibile, precum și protocoale experimentale stabilite. În plus, acestea sunt ușor de manevrat, iar cultivarea lor este ieftină. Cu toate acestea, toate aceste linii celulare sunt sisteme model foarte simple și artificiale. Ele sunt, în cea mai mare parte, derivate din tumori și reprezintă doar un singur tip de celule, nereflectând complexitatea mucoasei intestinale, care cuprinde mai multe tipuri de celule specializate. De asemenea, acestea sunt de obicei cultivate în două dimensiuni, ceea ce nu reflectă arhitectura tridimensională a intestinului nativ.
În special, pentru studiile privind detectarea nutrienților și secreția de hormoni intestinali, cultura primară de celule intestinale este o abordare mult mai bună și a fost stabilită ca un model fiabil în ultimii ani (Reimann et al., 2008). Culturile primare cultivate din cripte intestinale izolate au avantajul că pot fi generate din diferite segmente intestinale (Parker et al., 2012) și de la șoareci (animale de tip sălbatic sau knockout) (Diakogiannaki et al., 2013) sau de la oameni (Habib et al., 2013). Acestea cuprind enterocite absorbante, precum și diferite subtipuri de celule enteroendocrine, așa cum se găsesc în intestinul nativ. Cu toate acestea, aceste culturi conțin enterocite slab diferențiate și, prin urmare, nu sunt adecvate pentru detectarea transportatorilor și receptorilor intestinali la nivel proteic sau funcțional. Ele reprezintă un sistem de cultură pe termen scurt, nepotrivit pentru experimentele pe termen lung, și nu pot fi trecute, ceea ce mărește numărul de animale de laborator necesare pentru pregătirea culturilor. Același lucru este valabil și pentru celulele epiteliale intestinale izolate (Grossmann et al., 1998), care cuprind toate tipurile de celule mucoase, dar prezintă o viabilitate foarte limitată in vitro și nu reprezintă un epiteliu intact.
Stabilitatea pe termen scurt este, de asemenea, o limitare a explantelor tisulare, cum ar fi inelele intestinale evertite (Roder et al., 2014), sau sacii intestinali din intestinul de șoarece sau de șobolan (Praslickova et al., 2012; Surampalli et al., 2016), care sunt adesea utilizate pentru studii de transport. Inelele intestinale eviscerate pot fi fie incubate cu substraturi marcate in vitro, fie pot fi pregătite în urma administrării pe cale orală, de exemplu, a unor substraturi de transport marcate radioactiv la rozătoare (Roder et al., 2014). Sacii intestinali Everted pot fi utilizați chiar și pentru studii de flux, deoarece compartimentele luminal și bazolateral pot fi vizate separat. Cu toate acestea, pregătirea și manipularea nu sunt banale și necesită o anumită experiență. Avantajul explantelor tisulare este că acestea pot fi preparate din diferite segmente intestinale, iar caracteristicile lor specifice regiunii in vivo sunt păstrate in vitro. Explantul intestinal își păstrează arhitectura nativă, iar mucoasa este conectată la țesutul înconjurător, cum ar fi submucoasa sau mușchiul, și sunt incluși neuronii, limfa, vasele de sânge. În funcție de întrebarea științifică, acest lucru poate fi un avantaj sau un dezavantaj. Detectarea intestinală a nutrienților și secreția ulterioară de hormoni intestinali este uneori investigată în intestinul de rozătoare perfuzat (Kuhre et al., 2015). Animalul este anesteziat, iar lumenul intestinal este perfuzat cu stimulanți putativi ex vivo. Se colectează lichidul bazolateral, iar conținutul de hormoni intestinali este analizat. Această tehnică nu este ușoară din punct de vedere tehnic, iar obstacolele etice limitează utilizarea pe scară largă a acestei metode pentru studiile privind eliberarea de hormoni intestinali indusă de nutrienți.
Un model fiabil și bine stabilit utilizat pentru studii privind caracteristicile funcționale și reglarea transportatorilor intestinali este expresia heterologă în ovocite Xenopus laevis (Hirsch et al., 1996). În urma injectării ARNm, proteina de interes este exprimată în oocit, iar cinetica de transport poate fi investigată folosind substraturi marcate cu radio sau abordări electrofiziologice în cazul transportatorilor electrogeni (Schulze et al., 2014; Stelzl et al., 2016). Această tehnică este un instrument excelent pentru a studia caracteristicile funcționale ale unui anumit transportor, deși proteina-țintă se află într-un mediu artificial și nu sunt prezenți factori de reglare, așa cum ar fi în celula mamiferelor. În plus, disponibilitatea ovocitelor intacte și manipularea complicată, inclusiv injectarea ovocitelor, sunt aspecte critice care trebuie luate în considerare atunci când se aplică această tehnică. Sistemele de expresie heterologă mult mai simple sunt drojdia și E. coli. Acestea permit generarea de mutanți recombinanți care, odată generați, pot fi cultivați sau fermentați la scară mai mare, furnizând cantități mari de proteine. Deși ieftine și ușor de manevrat, aceste microorganisme sunt sisteme model foarte simplificate pentru investigarea proteinelor de mamifere și, în special, a proteinelor membranare mari. Problemele care apar deseori sunt plierea greșită a proteinei sau inserția eșuată în membrană. Prin urmare, aceste sisteme sunt mai degrabă mai utile pentru caracterizarea structurală a proteinelor purificate sau a domeniilor proteice (Beale et al., 2015) decât pentru studii detaliate privind funcția și reglarea transportatorilor de mamifere.
Abordări noi și promițătoare care au fost stabilite în trecutul foarte recent sunt modelele tridimensionale de culturi celulare de mamifere. Liniile de celule intestinale, cum ar fi CaCo-2 sau HT-29, sunt cultivate pe schele, creând o arhitectură mai asemănătoare cu cea a intestinului, ceea ce duce la o mai bună diferențiere (Chen et al., 2015). Alte modele tridimensionale sunt cultivate direct din celule epiteliale umane ale intestinului subțire și miofibroblaste pe membrane microporoase acoperite (Maschmeyer et al., 2015a; Maschmeyer et al., 2015b) și nu pot fi multiplicate in vitro. Aceste modele au potențialul de a fi stabilite pentru studii de transport al nutrienților sau al medicamentelor, iar culturile cultivate din celule epiteliale intestinale umane cuprind chiar și diferite tipuri de celule mucoase, dar nu și celule enteroendocrine. Același lucru este valabil și pentru țesuturile bioimprimate tridimensional, o altă tehnologie care a apărut foarte recent și care a câștigat o atenție enormă. Această abordare este mai valoroasă pentru medicina regenerativă și transplanturi decât pentru cercetarea experimentală (Murphy și Atala, 2014). Bioimprimarea diferitelor țesuturi, inclusiv a inimii, a pielii și a oaselor, a fost stabilită cu succes, dar țesuturile intestinale bioimprimate sunt rare până în prezent și trebuie să fie îmbunătățite în continuare (Wengerter et al., 2016).
.