Primul rol al lui Mary Lynn Rajskub a fost cel de Oompa-Loompa într-o producție de teatru comunitar a lui Willy Wonka & the Chocolate Factory, iar primul ei rol principal a fost Raggedy Ann. În 1996 a apărut în videoclipuri muzicale pentru melodiile „The Good Life” de Weezer și „The New Pollution” de Beck.
În perioada 1996-1998, a avut un rol recurent în serialul HBO The Larry Sanders Show în rolul asistentei de rezervări Mary Lou Collins.
Cel mai notabil rol al ei este cel de analist de sistem al UCT, Chloe O’Brian, în serialul 24, la care s-a alăturat în 2003, la începutul celui de-al treilea sezon al serialului. Personajul ei a fost un succes în rândul telespectatorilor și al criticilor și a fost unul dintre puținii membri ai distribuției care a revenit în cel de-al patrulea sezon al serialului. După ce a fost o vedetă invitată obișnuită timp de două sezoane, Rajskub a devenit un membru principal al distribuției în cel de-al cincilea sezon al serialului. Până la finalul serialului, ea era femeia principală, cu un rol de prim-plan al doilea după Kiefer Sutherland. Personajul ei a avut, de asemenea, onoarea de a rosti ultimele cuvinte ale serialului în finalul sezonului 8. Rajskub și Sutherland au apărut pentru scurt timp ca personajele lor 24 într-un episod din 2007, „24 de minute”, din serialul animat Fox The Simpsons. În august 2013, s-a anunțat că își va relua rolul Chloe O’Brian în seria limitată din 2014 24: Live Another Day.
Rajskub a fost unul dintre membrii distribuției originale a serialului Mr. A apărut în serialul The Sketch Show al lui Kelsey Grammer de pe postul de televiziune Fox, în The King of Queens ca personaj numit Priscilla, și în numeroase filme, inclusiv Mysterious Skin, Legally Blonde 2, Sweet Home Alabama, Dude, Where’s My Car? Man on the Moon, Punch-Drunk Love, The Anniversary Party, Firewall, Little Miss Sunshine, videoclipuri muzicale pentru Beck, Weezer și Sheryl Crow, precum și interpretarea unei femei oarbe în filmul Road Trip.
Rajskub a făcut parte dintr-un duo comic (cu Karen Kilgariff) numit Girls Guitar Club. În 2006, a avut o apariție cameo în „Partings”, finalul celui de-al șaselea sezon din Gilmore Girls, unde a jucat rolul unei trobairitz care își caută marea șansă. (Rajskub apăruse anterior în serialul Gilmore Girls în rolul principal feminin din „A Film by Kirk”, un scurtmetraj realizat de personajul Kirk Gleason). Ea s-a oferit voluntar ca actriță în cadrul programului Young Storytellers. Ea are un trecut educațional ca pictoriță, după ce a urmat cursurile Institutului de Artă din San Francisco.
Rajskub a fost nominalizată de două ori pentru un premiu Screen Actors Guild; o dată în 2005 și din nou în 2007 pentru Performanță remarcabilă a unui ansamblu într-un serial dramatic. A fost invitată în episodul „Prime Minister” din Flight of the Conchords, în rolul lui Karen, o fanatică a lui Art Garfunkel. A jucat ca invitată în rolul „Gail melcul” într-un episod din „It’s Always Sunny in Philadelphia” intitulat „The Gang Gives Frank an Intervention” și a reluat rolul în finalul celui de-al nouălea sezon, „The Gang Squashes Their Beefs”, și în sezonul treisprezece „The Gang Beats Boggs”: Ladies Reboot”. În 2009, a apărut, de asemenea, în filmul Julie & Julia în rolul lui Sarah, una dintre prietenele apropiate ale lui Julie Powell. În 2010, Rajskub a făcut stand-up în emisiunea lui John Oliver „New York Stand Up Show”. În iunie 2010, a apărut în episodul „Lovesick” din timpul celui de-al doilea sezon al serialului american Royal Pains.
Între iulie și octombrie 2010, a jucat în spectacolul ei solo, Mary Lynn Spreads Her Legs, la Steve Allen Theater din Los Angeles. Criticul F. Kathleen Foley, de la Los Angeles Times, a scris: „acest titlu vesel și vulgar rezumă tonul general, care este adesea ușor obscen”. Spectacolul, scris de Rajskub cu ajutorul regizorului/dezvoltatorului Amit Itelman, a fost inspirat de experiențele lui Rajskub în ceea ce privește sarcina, nașterea și primii ani de maternitate.
În ianuarie 2011, Rajskub a jucat în episodul „Our Children, Ourselves” din cel de-al doilea sezon al serialului Modern Family de pe ABC. În toamna anului 2011, Rajskub a apărut în serialul de scurtă durată How to Be a Gentleman. Tot în 2011, serialul web al lui Rajskub, Dicki, a început să fie difuzat pe My Damn Channel. Dicki se bazează pe o serie de persoane cu care Rajskub a crescut în cadrul și în jurul orașului Michigan. Personajul principal este o femeie de 40 de ani care locuiește acasă cu părinții ei, face artizanat și își ia arta în serios. Dicki a fost unul dintre cele mai de succes seriale web de la My Damn Channel până în prezent. Primul sezon s-a încheiat în noiembrie 2011, dar un al doilea sezon este în curs de dezvoltare. Rajskub a jucat în ediția din iunie 2012 a emisiunii Don’t Tell My Mother! (Live Storytelling), o emisiune lunară în care celebritățile împărtășesc povești adevărate pe care nu ar vrea ca mamele lor să le afle. În prezent, ea găzduiește un podcast pe Nerdist Network numit Kickin’ it Mary Lynn Style.
În 2013, Rajskub a apărut în cel de-al patrulea sezon din Arrested Development într-un rol tăcut, dar bine primit, ca Heartfire, un personaj despre care Rajskub a spus că „vorbește din inimă, dar nu folosește cuvinte”. În același an, Rajskub a apărut, de asemenea, în serialul web All Growz Up cu Melinda Hill.
Rajskub a apărut în podcastul TV Guidance Counselor al lui Ken Reid pe 27 martie 2015.
În august 2016, Rajskub a apărut la Festivalul Fringe de la Edinburgh în 24 Hours With Mary Lynn Rajskub și a fost bine primită de fani și critici.
În 2017, Rajskub a apărut în primul sezon al serialului Dream Corp LLC de la Adult Swim, jucând rolul pacientului 46 în episodul „Are You Down With OCD?”.
În 2018, Rajskub a apărut în Night School alături de Kevin Hart, Tiffany Haddish, Rob Riggle, Taran Killam, Megalyn Echikunwoke, Al Madrigal, Anne Winters, Fat Joe și Keith David.
În 2021, Rajskub a lansat o comedie specială de 49 de minute intitulată Mary Lynn Rajskub: Live from the Pandemic; aceasta poate fi închiriată sau cumpărată prin intermediul mai multor servicii de video la cerere.
.