În studiul nostru, am detectat retrospectiv prezența mutațiilor CALR într-o cohortă de 524 de pacienți JAK2 V617F-negativi care s-au prezentat cu suspiciune clinică și/sau de laborator de NMP, cu scopul principal de a determina valoarea diagnostică a acestei detecții. În perioada observată, în centrul nostru, mutațiile CALR nu fuseseră investigate de rutină la pacienții cu suspiciune de MPN, deoarece acestea au fost descoperite doar recent1,2. În schimb, mutația JAK2 V617F a fost deja analizată de rutină de la descoperirea sa în 200520. Prin urmare, pacienții JAK2 V617F-pozitivi au fost excluși din studiu. O mutație MPL este o constatare relativ rară la pacienții cu MPN și este prezentă mai ales la pacienții cu ET sau PMF21. În laboratorul nostru, testarea MPL a fost inclusă în algoritmul de diagnosticare la pacienții cu suspiciune de MPN abia recent și este efectuată numai după excluderea mutațiilor JAK2 V617F și CALR. Prin urmare, statutul MPL nu a fost definit la toți pacienții noștri în momentul primei examinări.
Centrul nostru este un spital medical universitar care deservește o zonă cu aproximativ 1.000.000 de locuitori și este un centru de referință pentru tumori hematologice maligne. Toți pacienții trimiși la departamentul de hematologie au fost evaluați inițial de medici generaliști fără cunoștințe detaliate în domeniul tumorilor maligne hematologice. După cum se prezintă în tabelul 3, doar o parte dintre pacienții trimiși la departamentul de hematologie aveau parametri patologici clinici și/sau de laborator suspecți de NMP la momentul primei examinări. Prin urmare, majoritatea pacienților care au fost trimiși la Departamentul de hematologie au fost persoane fără o afecțiune hematologică malignă, deoarece am stabilit că 380 de pacienți (380/524 = 72,5%) nu prezentau NMP. Acești pacienți au fost diagnosticați cu modificări secundare ale conținutului de sânge periferic cauzate de diferite afecțiuni, cum ar fi deficiența de fier, boli infecțioase și inflamatorii, hiposplenism, malignitate, fumat, intervenții chirurgicale recente, utilizarea de corticosteroizi și hipoxie cronică. În consecință, numărul de pacienți CALR-pozitivi din cohorta noastră a fost scăzut. Am identificat 4,4% dintre pacienții suspectați de MPN ca fiind CALR pozitivi, dintre care majoritatea au fost diagnosticați fie cu ET, fie cu PMF. Majoritatea studiilor similare au analizat numărul de pacienți CALR-pozitivi cu MPN confirmată; prin urmare, numărul de pacienți CALR-pozitivi a fost mult mai mare, variind de la 12 la mai mult de 20%22,23,23,24,25,26. Pe baza datelor noastre, ar fi benefică îmbunătățirea abordării de diagnosticare a pacienților cu niveluri crescute ale uneia sau mai multor linii de celule sanguine, deoarece, în majoritatea cazurilor, acest lucru nu este cauzat de o malignitate hematologică. Pacienții ar trebui să fie supuși unui screening de rutină pentru cele mai frecvente cauze de eritrocitoză secundară, trombocitoză și leucocitoză, iar hemoleucograma ar trebui să fie repetată cel puțin o dată la vizitele de monitorizare înainte de a fi trimiși la Departamentul de Hematologie. Testarea genetică moleculară trebuie rezervată pacienților cu suspiciune ridicată de boală hematologică clonală și nu trebuie efectuată la toți pacienții trimiși la Departamentul de Hematologie.
Mutațiile CALR sunt frecvent identificate la pacienții JAK2 V617F-negativi cu ET1,2. În centrul nostru, doar o minoritate de pacienți CALR-pozitivi (7/23 = 30%) au fost diagnosticați cu ET în conformitate cu criteriile OMS 2008 în momentul primei examinări. Motivul principal a fost rezerva relativă față de examinarea măduvei osoase la pacienții cu trombocitoză moderată și cu un risc scăzut de complicații trombotice. Totuși, acest lucru înseamnă că am fi putut subestima numărul de pacienți cu trombocitoză clonală. Prin confirmarea prezenței mutațiilor CALR, am reușit să diagnosticăm retrospectiv 9 pacienți cu ET în conformitate cu criteriile OMS modificate pentru ET13. Deși toți acești pacienți au fost urmăriți în cadrul departamentului nostru din cauza suspiciunii ridicate de trombocitoză clonală, este foarte benefic din punct de vedere prognostic și terapeutic să se poată confirma diagnosticul de ET printr-o procedură neinvazivă, cum ar fi testarea genetică moleculară. Mutațiile CALR sunt, prin urmare, semne distinctive importante de diagnostic pentru ET, așa cum a fost, de asemenea, confirmat recent în literatura de specialitate27,28.
Toți pacienții cu PMF au fost diagnosticați conform criteriilor OMS în momentul examinării la Departamentul de Hematologie. Identificarea mutației CALR a confirmat retrospectiv diagnosticul, dar nu a avut un impact diagnostic sau terapeutic direct.
CMML este un subtip de SMD/MPN și nu strict MPN12. Mutațiile CALR la pacienții cu CMML sunt extrem de rare și nu joacă un rol important în patogeneza acesteia. Un studiu de grup realizat de Zamora et al. a arătat că doar 1 din 174 de pacienți cu CMML a prezentat o mutație CALR29. Pacientul din studiul nostru care a fost diagnosticat cu CMML de tip unu și care ulterior a evoluat spre mielofibroză ar fi putut fi diagnosticat greșit în momentul primei examinări, deoarece PMF și CMML au multe caracteristici comune, inclusiv monocitoza și fibroza măduvei osoase. Într-un studiu recent realizat de Hu et al. o analiză mai precisă a permis ca mulți pacienți diagnosticați cu CMML să fie reclasificați ca având PMF, arătând că ar trebui efectuată o analiză mai aprofundată pentru a pune un diagnostic precis, în special la pacienții cu biomarkerii moleculari tipici pentru ET/PMF11,30.
Au fost descrise peste 50 de mutații CALR cu deplasare de cadru și toate sunt localizate în exonul 9 al genei CALR. Există două tipuri principale de mutații CALR: tipul 1 (o deleție de 52-bp; p.L367fs*46) și tipul 2 (o inserție TTGTC de 5-bp; p.K385fs*47). Pe baza caracteristicilor lor moleculare, alte mutații pot fi grupate ca fiind de tip 1 asemănătoare și de tip 2 asemănătoare31. În studiul nostru, cel mai frecvent tip de mutație CALR a fost de tip 1, ceea ce este în concordanță cu datele din literatura de specialitate2,16,32. Mutațiile care nu sunt nici de tip 1, nici de tip 2 ar trebui să fie subclasificate ca fiind de tip 1-like sau de tip 2-like, deoarece acest lucru poate avea un impact asupra fenotipului clinic și, în cazul PMF, chiar asupra supraviețuirii17. Mutațiile de tip 1 și de tip 2 din studiul nostru au fost definite prin utilizarea AGADIR15, un algoritm de aproximare statistică care calculează propensiunea la helix pentru cele 31 de secvențe unice de aminoacizi care sunt alterate de mutațiile CALR16. Acest algoritm a fost utilizat în studii similare și reprezintă un instrument important în subclasificarea mutațiilor CALR16,17. Pare extrem de important să se definească în mod corespunzător tipul de mutație CALR, deoarece acest lucru are, de asemenea, un impact diagnostic. Se știe că numai mutațiile care duc la o deplasare de cadru + 1 (-1 + 2) a cadrului de citire sunt patogene6. Alte mutații CALR pot fi variante germinale ale CALR cu o semnificație clinică necunoscută. În studiul nostru, au fost detectate mutații CALR non-frameshift la doi pacienți. Unul dintre acești pacienți a fost diagnosticat cu trombocitoză reactivă în momentul examinării la Departamentul de Hematologie și a fost definit retrospectiv ca fiind CALR-pozitiv. O analiză detaliată a confirmat o mutație CALR de tip missense care are ca rezultat înlocuirea acidului glutamic cu acid aspartic la poziția 398 a aminoacidului. Aceeași mutație a fost descoperită la un pacient cu leucemie cronică neutrofilică (CNL) definită de OMS într-un studiu realizat de Lasho et al. Studiul său a concluzionat că mutațiile CALR care nu au ca rezultat generarea unei terminații C distincte sunt sugestive pentru un mecanism patogenic diferit care ar putea fi încă necunoscut33. În studiul nostru, am presupus că pacientul nostru nu a dezvoltat o mutație CALR care să implice o boală hematologică clonală. Conform anamnezei pacientului, examenului clinic și rezultatelor de laborator, acestea au fost în mare parte sugestive pentru o trombocitoză reactivă. La momentul redactării acestui articol, pacientul se afla într-o stare de sănătate bună, fără posibile complicații asociate cu boala hematologică clonală.
Un alt pacient cu o mutație CALR non-frameshift a fost diagnosticat cu MPN-U. Acest pacient era purtător al unei deleții germinale in-frame în gena CALR (NM_004343.3 (CALR):c.1142_1144delAGG; p.(Glu381del)), care fusese deja recunoscută la un pacient simptomatic cu MPN34. Deși motivul KDEL a fost păstrat, deleția unui aminoacid (p.(Glu381del)) a dus la alterarea structurii secundare a proteinei, precum și a structurii tridimensionale, ceea ce a dus la concluzia naturii patogene a acestei deleții in-frame23,34,35. Pacientul nostru cu MPN-U a fost, din păcate, pierdut la urmărire, iar un diagnostic hematologic exact sau eventualele complicații nu au putut fi definite. Cu toate acestea, rezultatele de laborator au fost sugestive pentru o boală hematologică clonală.
În studiul nostru, am descoperit patru noi mutații CALR în exonul 9 care, după cunoștințele noastre, nu au fost încă înregistrate în baza de date COSMIC (https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic) sau HGMD (http://www.hgmd.cf.ac.uk). Baza de date COSMIC este cea mai mare bază de date din lume, curată de experți, de mutații somatice în cancerul uman. Aceasta descrie peste 4 milioane de mutații codificatoare36. Baza de date HGMD reprezintă o încercare de a colaționa toate leziunile genetice cunoscute (publicate) responsabile de bolile ereditare umane19. Mutațiile noi care au fost definite în studiul nostru sunt NM_004343.3 (CALR):c.1127_1145del19, p.(Arg376Glnfs*48), NM_004343.3 (CALR):c.1154_1154delAinsGTTGTC, p.(Lys385Serfs*47), NM_004343.3 (CALR):c.1154_1154delAinsTTTATC, p.(Lys385Ilefs*47), și NM_004343.3 (CALR):c.1132_1153del22, p.(Glu378Argfs*45). Toate aceste mutații au fost mutații de tip 2.
ET și PMF sunt asociate cu un risc crescut de evenimente trombotice și tromboembolice, care reprezintă cauze importante de morbiditate și mortalitate37. Reducerea riscului de complicații trombotice și tromboembolice este unul dintre cele mai importante obiective ale tratamentului, în special la pacienții cu ET38. Acești pacienți prezintă, de asemenea, un risc mai mare de complicații hemoragice, care pot fi legate de complicații ale tratamentului sau de sindromul von Willebrand dobândit (AVWS) din cauza trombocitozei extreme (trombocite > 1000 × 109/L)28,39,40. Riscul de tromboză la pacienții cu ET depășește 20%41. Într-un studiu suedez, 35% dintre pacienții cu ET au dezvoltat complicații vasculare42. În PMF, evenimentele trombotice sunt aproximativ la fel de frecvente ca în ET43. Prevalența pentru complicațiile trombotice la pacienții cu PMF variază între 7 și 30%44,45,46. În studiul nostru, prevalența complicațiilor trombotice la pacienții CALR-pozitivi a fost de 30%. Cu toate acestea, trei pacienți au dezvoltat o complicație trombotică cu mai mult de 10 ani înainte de a se suspecta diagnosticul de MPN. Prin urmare, prevalența reală a complicațiilor trombotice în studiul nostru a fost mai mică. Un pacient a dezvoltat o hemoragie vitreană care a fost rezultatul unui tratament anticoagulant inadecvat cu warfarină. Niciunul dintre cei doi pacienți cu o complicație hemoragică nu a avut trombocitoză extremă la momentul complicației. Comparativ cu mutațiile JAK2 V617F și MPL, CALR este o mutație favorabilă și este asociată cu o incidență mai mică a evenimentelor trombotice1,2,47. Majoritatea pacienților CALR-pozitivi care au dezvoltat complicații trombo-hemoragice au fost diagnosticați cu mutații de tip 1 (71,4 %). După cum s-a arătat deja, pacienții cu mutații de tip 1 au prezentat un risc mai mare de tromboză în comparație cu pacienții cu mutații de tip 210.
Mutațiile CALR sunt cunoscute în prezent ca fiind unul dintre cele trei tipuri majore de mutații, pe lângă JAK2 V617F și mutația MPL, la pacienții cu ET sau PMF. Cu toate acestea, existau încă 10-15% dintre pacienții cu ET sau PMF cu un marker genetic molecular necunoscut care stă la baza bolii. Acești pacienți sunt numiți „triplu negativi „48. La acești pacienți, au fost căutați noi biomarkeri moleculari prin secvențierea exonilor codificatori în genele cancerului mieloid, ceea ce a dat rezultate promițătoare. Acest lucru ar putea oferi o abordare personalizată a diagnosticului la pacienții cu MPN49.
Mutațiile CALR la pacienții cu MPN sunt, de asemenea, în curs de investigare pentru potențialul lor terapeutic50,51,52. Mutațiile exonului 9 al CALR ar putea fi ținte pentru terapia imună a cancerului, deoarece s-a demonstrat că acestea acționează ca neo-antigeni imunogeni51. În tratamentul NMP, ar putea fi benefică combinarea vaccinurilor CALR cu tratamente imunomodulatoare53 , cum ar fi interferonul-alfa (IFN-α)54 sau ligandul morții programate 1 (PD-L1)55 , ca o vaccinare combinatorie împotriva cancerului53. Mutațiile CALR, pe lângă faptul că sunt markeri importanți de diagnostic și prognostic la pacienții cu MPN, ar putea deveni în viitor o țintă terapeutică importantă într-un subgrup de pacienți cu MPN.
.