4.3. Structura receptorului nicotinic
Receptorul nicotinic al organului electric și al mușchiului scheletic al vertebratelor este un pentamer compus din patru subunități distincte (a, b, g și d) în raport stoichiometric de 2:1:1:1:1, respectiv. În plăcile terminale musculare mature, inervate, subunitatea g este înlocuită cu e, o subunitate strâns înrudită. Subunitățile individuale sunt identice în proporție de aproximativ 40% în ceea ce privește secvențele lor de aminoacizi, provenind dintr-o genă primordială comună. Receptorul nicotinic a devenit prototipul altor canale ionice pentamerice portate de ligand, care au inclus receptorii pentru aminoacizii inhibitori (acidul g-aminobutiric și glicina) și anumiți receptori ai serotoninei (5-HT3). Fiecare dintre subunitățile receptorului pentameric are o masă moleculară cuprinsă între 40 000 și 60 000 de daltoni. Cele 210 reziduuri amino-terminale constituie practic întregul domeniu extracelular. Acesta este urmat de patru domenii transmembranare (TM); regiunea dintre al treilea și al patrulea domeniu formează cea mai mare parte a componentei citoplasmatice. Fiecare dintre subunitățile din cadrul receptorului nicotinic ACh are o expunere extracelulară și una intracelulară pe membrana postsinaptică. Cele cinci subunități sunt dispuse în jurul unei pseudo-axe de simetrie pentru a circumscrie un canal situat intern,.
Receptorul este o moleculă asimetrică (14 nm×8 nm) de 250 000 daltoni, cu cea mai mare parte a domeniului nemembranar pe suprafața extracelulară. În zonele de joncțiune (de exemplu, placa terminală motorie din mușchii scheletici și suprafața ventrală a organului electric), receptorul este prezent la densități ridicate (10 000/mm2) într-o ordine de împachetare regulată. Această ordonare a receptorilor a permis reconstrucția imaginii la microscopul electronic a structurii sale moleculare. O proteină de legare a ACh omologă doar cu domeniul extracelular al receptorului nicotinic a fost identificată la melcii de apă dulce și de apă sărată și a fost caracterizată structural și farmacologic.
Această proteină se asamblează ca un pentamer homomeric și se leagă de liganzii receptorului nicotinic cu selectivitatea așteptată; structura sa cristalină relevă o organizare atomică așteptată a receptorului nicotinic. Mai mult decât atât, fuziunea proteinei de legare a ACh și a porțiunilor transmembranare ale receptorului produce o proteină funcțională care prezintă canalul de porniri și schimbările de stare așteptate de la receptor. Această proteină de legare servește atât ca un surogat structural, cât și funcțional al receptorului și a oferit o înțelegere detaliată a factorilor determinanți care guvernează specificitatea ligandului receptorului nicotinic. Locurile de legare a agonistului se găsesc la interfețele subunităților, dar în mușchi, doar două dintre cele cinci interfețe ale subunităților, a g și a d, au evoluat pentru a lega liganzi. Legarea agoniștilor, a antagoniștilor competitivi reversibili și a toxinei elapid a se exclude reciproc și implică suprafețe suprapuse pe receptor. Ambele subunități care formează interfața subunității contribuie la specificitatea ligandului. Măsurătorile conductanțelor membranare demonstrează că ratele de translocare a ionilor sunt suficient de rapide (5×107 ioni pe secundă) pentru a necesita translocarea ionilor printr-un canal deschis, mai degrabă decât printr-un purtător rotativ de ioni. Mai mult decât atât, modificările de permeabilitate ionică mediate de agonist (de obicei, o mișcare de intrare a Na+ în primul rând și, în al doilea rând, a Ca2+) au loc prin intermediul unui canal cationic intrinsec structurii receptorului. Cea de-a doua regiune transmembranară de pe fiecare dintre cele cinci subunități formează perimetrul intern al canalului. Situl de legare a agonistului este intim cuplat cu un canal ionic; în receptorul muscular, legarea simultană a două molecule de agonist are ca rezultat o schimbare conformațională rapidă care deschide canalul. Atât răspunsul de legare, cât și cel de deschidere prezintă o cooperativitate pozitivă. Detaliile privind cinetica deschiderii canalului au evoluat datorită tehnicilor electrofiziologice de patch-clamp care disting evenimentele individuale de deschidere și închidere ale unei singure molecule de receptor și confirmă faptul că receptorii nicotinici de acetilcolină (nAChR) sunt canale ionice pentamerice ligandgated care este compus din subunități care constau dintr-un domeniu extracelular care poartă situsul de legare a ligandului și un domeniu distinct de pori ionici. Transducția semnalului rezultă din cuplarea alosterică dintre cele două domenii, distanța de la situsul de legare la poarta domeniului porului fiind de 50 Å. Cu toate acestea, studiile de legare a receptorilor sunt specifice receptorilor colinergici nicotinici, care au fost efectuate pe epiteliile vestibulare izolate ale broaștelor Rana catesbiana și Rana temporaria. Se prezintă dovezi privind prezența receptorilor colinergici de tip nicotinic asociați în mod specific cu zonele senzoriale și se studiază legarea conformațiilor atipice ale agonistului nicotinic care conferă selectivitate de subtip și se concluzionează că nAChR are un rol crucial în neurotransmisia excitatorie și reprezintă o țintă importantă pentru medicamente și insecticide. Diverse subtipuri de nAChR cu diverse combinații de subunități care conferă selectivitate diferențială pentru medicamentele nicotinice și, de asemenea, a identificat o familie de gene care codifică proteine omoloage cu subunitatea α a receptorului nicotinic al acetilcolinei musculare în genomul șobolanului. Aceste gene sunt transcrise în sistemele nervoase centrale și periferice, în zonele despre care se știe că conțin receptori nicotinici funcționali. Rolul jucat de receptorii nicotinici neuronali care conțin β2 (nAChRs) în medierea efectelor secundare ale nicotinei la făt și la nou-născut. Șoarecilor WT gravide și șoarecilor mutanți lipsiți de subunitatea β2 nAChR au fost implantați cu minipompe osmotice care au administrat fie apă, fie o doză controlată de nicotină. Ulterior, s-a constatat o comparare a dezvoltării sistemului simpatico-suprarenal și a reflexelor de respirație și de excitare ale urmașilor la scurt timp după naștere, o perioadă de vulnerabilitate crescută la expunerea la nicotină. Pe de altă parte, neonicotinoidele, precum imidaclopridul, sunt agoniști nAChR cu o puternică activitate insecticidă. De la introducerea sa la începutul anilor 1990, imidaclopridul a devenit unul dintre cele mai utilizate insecticide, atât pentru protecția culturilor, cât și pentru aplicațiile de sănătate animală, baza moleculară a rezistenței la imidacloprid, cinci subunități nAChR (Nlα1-Nlα4 și Nlβ1) au fost clonate din Nilaparvata lugens. O comparație a genelor subunităților nAChR din populațiile sensibile la imidacloprid și din populațiile rezistente la imidacloprid a identificat o singură mutație punctiformă într-o poziție conservată (Y151S) în două subunități nAChR, Nlα1 și Nlα3. O corelație puternică între frecvența mutației punctuale Y151S și nivelul de rezistență la imidacloprid a fost demonstrată prin PCR specifică alelei. Prin exprimarea nAChR-urilor hibride care conțin subunități α de Nilaparvata lugens și β2 de șobolan, s-au obținut dovezi care demonstrează că mutația Y151S este responsabilă de o reducere substanțială a legăturii specifice la imidacloprid. Acest studiu oferă dovezi directe pentru apariția rezistenței la situsul țintă la un insecticid neonicotinoid și a investigat cu privire la natura situsului de legare a cationilor-π în receptorul nicotinic și constată că receptorul nicotinic al acetilcolinei este prototipul canalului ionic legat de ligand. Au fost identificați o serie de aminoacizi aromatici care contribuie la situsul de legare a agonistului, sugerând că interacțiunile cation-π pot fi implicate în legarea grupului de amoniu cuaternar al agonistului, acetilcolina. Conformația moleculelor colinergice la nivelul receptorilor nervoși nicotinici și găsește o corelație a analizelor structurii cristaline ale agoniștilor nicotinici puternici acetilcolină, acetil-α-metilcolină, lactoilcolină, 1,1-dimetil-4-fenilpiperazină și nicotină permite determinarea conformației agoniștilor colinergici relevanți pentru receptorii nervoși nicotinici. Expresia receptorilor de neurotransmițători codificați de ARNm izolați din trei linii celulare de gliom uman. Ovocitele injectate cu ARNm din două linii celulare de glioblastom nu au prezentat răspunsuri electrice la diverși neurotransmițători testați.
Modularea nAChR de către stricnină constată că stricnina este un antagonist puternic și selectiv la receptorii de glicină, care s-a dovedit a inhiba receptorii nicotinici ai acetilcolinei (AcChoR) musculari (α 1β 1γ δ, α 1β 1γ și α 1β 1δ) și neuronali (α 2β 2 și α 2β 4) exprimați în ovocite Xenopus. Stricnina singură (până la 500 µmol/L) nu a provocat curenți de membrană în ovocite care exprimă AcChoRs, dar atunci când a fost aplicată înainte, concomitent sau în timpul suprafuziei cu acetilcolină (AcCho), aceasta a inhibat rapid și reversibil curentul provocat de AcCho (curentul AcCho). Traducerea ARN-ului mesager exogen care codifică pentru nAChRs produce receptori funcționali în ovocitele Xenopus, în acest studiu ARN-ul mesager extras din organul electric al lui Torpedo a fost injectat în ovocitele Xenopus. Acest lucru a dus la sinteza și încorporarea de receptori de acetilcolină funcționali în membrana ovocitelor. Atunci când sunt activați de acetilcolină, acești receptori de acetilcolină Torpedo din membrana ovocitelor au deschis canale a căror permeabilitate ionică seamănă cu cea a receptorilor nicotinici din alte celule.
Localizarea receptorilor de acetilcolină (AChR) la suprafața celulelor miogenice în curs de dezvoltare ale mușchilor latissimus dorsi anteriori și posteriori ai embrionului de pui în relație cu procesul de inervație a fost studiată la nivel ultrastructural utilizând un conjugat peroxidază de hrean-α-bungarotoxină. Concentrații localizate de AChR au fost găsite în regiuni mici 0,1-0.4 µm în lățime pe suprafața celulelor miogenice din mușchii de 10 până la 14 zile și, de asemenea, au fost studiate efectele acetilcolinei și ale agenților care imită sau blochează acțiunile sale fiziologice asupra concentrațiilor de guanozină 3′:5′-fosfat ciclic (GMP ciclic) și adenozină 3′:5′-fosfat ciclic (AMP ciclic) în felii de cortex cerebral, ventriculul cardiac și ileon de mamifere. Acetilcolina și agenții colinomimetici cu acțiune predominant muscarinică, cum ar fi metacolina, betanecolul și pilocarpina, au indus o creștere a concentrației de GMP ciclic sau o ușoară scădere a concentrației de AMP ciclic, în toate cele trei țesuturi studiate.
Proprietățile funcționale și localizarea celulară a receptorului α7 AcCho uman neuronal (α7 AcChoR) și a formei sale mutante L248T (mut) au fost investigate prin exprimarea lor singură sau ca fuziuni de gene cu versiunea îmbunătățită a proteinei fluorescente verzi (GFP). Ovocitele Xenopus injectate cu ADNc de tip sălbatic, mutα7 sau cu subunitățile chimerice au exprimat receptori care au declanșat curenți de membrană atunci când au fost expuse la AcCho. După cum se știe deja, curenții AcCho generați de receptorii wtα7 scad mult mai repede decât cei declanșați de receptorii mutα7. Interacțiunea receptorilor nicotinici β2 și a căilor dopaminergice în controlul locomoției spontane, și constată că acetilcolina (ACh) este un modulator cunoscut al activității neuronilor dopaminergici (DAergici) prin stimularea nAChR-urilor. Cu toate acestea, compoziția subunităților și localizarea specifică a nAChRs implicate în locomoția mediată de DA rămân să fie stabilite in vivo. Șoarecii lipsiți de subunitatea β2 a nAChRs (β2KO) prezintă o hiperactivitate izbitoare în câmp deschis, ceea ce sugerează un dezechilibru în neurotransmisia DA. Cu toate acestea, mutația în cadrul domeniului M2 al receptorului nicotinic convertește 5-hidroxitriptamina din antagonist în agonist, studiul a fost realizat asupra efectelor 5-hidroxitriptaminei (5HT) asupra receptorilor nicotinici neuronali homomerici (nAcChoR) exprimați în ovocite de Xenopus după injectarea ADNc care codifică subunitatea de pui de tip sălbatic. AcCho a declanșat curenți mari care au fost reduși de 5HT într-o manieră reversibilă și dependentă de doză, cu o concentrație semi-inhibitorie și un coeficient Hill. Deși studiul receptorului colinergic al limfocitelor T citotoxice și al agoniștilor colinergici au capacitatea limfocitelor sensibilizate de a leza celulele purtătoare de aloantigeni sensibilizatori, receptorul colinergic al populației de limfocite atacatoare a fost studiat prin manipularea farmacologică a unui sistem in vitro care cuantifică leziunea mediată de celulele atacatoare sensibilizate asupra celulelor țintă.
.