Protocol CTAB pentru izolarea ADN-ului din țesuturi vegetale

de

Vizitatori din SUA și Canada, solicitați AICI o EȘANTIOARĂ GRATUITĂ a kitului nostru de extracție a ADN-ului din plante SYNERGY™ 2.0 pe bază de CTAB.

Isolarea ADN-ului din țesuturi vegetale poate fi foarte dificilă, deoarece biochimia dintre speciile de plante divergente poate fi extremă. Spre deosebire de țesuturile animale, unde același tip de țesut de la specii diferite are de obicei caracteristici similare, plantele pot avea niveluri variabile de metaboliți și biomolecule structurale. Polizaharidele și polifenolii sunt două clase de biomolecule vegetale care variază foarte mult de la o specie la alta și sunt foarte problematice atunci când se izolează ADN-ul. Polizaharidele și polifenolii contaminanți pot interfera cu manipulările ADN-ului după izolare.

Există metode care elimină eficient polizaharidele și polifenolii din preparatele de ADN vegetal. Utilizarea CTAB (bromură de cetil trimetilamoniu), un detergent cationic, facilitează separarea polizaharidelor în timpul purificării, în timp ce aditivii, cum ar fi polivinilpirolidona, pot ajuta la eliminarea polifenolilor. Tampoanele de extracție pe bază de CTAB sunt utilizate pe scară largă la purificarea ADN din țesuturile vegetale.

O opțiune pentru purificarea ADN folosind CTAB exploatează faptul că polizaharidele și ADN-ul au solubilități diferite în CTAB în funcție de concentrația de clorură de sodiu. La concentrații mai mari de sare, polizaharidele sunt insolubile, în timp ce la concentrații mai mici ADN-ul este insolubil. În consecință, prin ajustarea concentrației de sare în lizații care conțin CTAB, polizaharidele și ADN-ul pot fi precipitate diferențiat.

Polifenolii sunt compuși care conțin mai mult de un inel fenolic (de exemplu, taninul), o structură care se leagă foarte eficient de ADN. Aceștia sunt prezenți în mod natural în plante, dar sunt, de asemenea, generați atunci când plantele prezintă leziuni tisulare (brunificare). La omogenizarea țesuturilor vegetale, polifenolii sunt sintetizați de polifenoli prin polifenol-oxidaza eliberată. Adăugarea de polivinil pirrolidonă previne interacțiunea dintre ADN și inelele fenolice prin legarea polifenolilor.

Protocoalele pe bază de CTAB tind să funcționeze foarte bine, dar un dezavantaj semnificativ este faptul că extracțiile cu cloroform sunt utilizate în mod obișnuit pentru a separa moleculele organice solubile de ADN. Deoarece cloroformul este cancerigen, multe instituții dezaprobă utilizarea sa. Astfel, o metodă alternativă care evită cloroformul a fost dezvoltată de OPS Diagnostics; aceasta poate fi găsită pe pagina Synergy™ Plant DNA Extraction Kit.

Materiale

  • Buffer CTAB: 2% bromură de cetil trimetilamoniu, 1% polivinil pirolidonă, 100 mM Tris-HCl, 1.4 M NaCl, 20 mM EDTA, sau tampon de extracție CTAB
  • Centrifugare (până la 14.000 x g)
  • Soluție de Rnază A
  • Isopropanol
  • Etanol 70%
  • Tuburi de centrifugare de 2 ml
  • SpeedVac
  • Buffer TE (10 mM Tris, pH 8, 1 mM EDTA)

Metodă

Eșantioanele de plante pot fi pregătite prin măcinarea criogenică a țesuturilor într-un mortar și un pisălog după ce au fost răcite în azot lichid. Plantele liofilizate pot fi măcinate la temperatura camerei. În ambele cazuri, o pulbere fină este cea mai bună pentru extragerea ADN-ului.

  1. Pentru fiecare 100 mg de țesut omogenizat se utilizează 500 µl de tampon de extracție CTAB. Se amestecă și se vortexează bine. Se transferă omogenatul într-o baie de 60°C timp de 30 de minute.
  2. După perioada de incubare, centrifugați omogenatul timp de 5 minute. la 14.000 x g.
  3. Transferați supernatantul într-un nou tub. Se adaugă 5 µl de soluție de RNază A și se incubează la 37°C timp de 20 de minute
  4. Adaugați un volum egal de cloroform/alcool izoamilic (24:1). Vortexați timp de 5 secunde, apoi centrifugați proba timp de 1 minut la 14.000 x g pentru a separa fazele. Se transferă faza superioară apoasă într-un nou tub. Se repetă această extracție până când faza superioară este limpede.
  5. Transferați faza apoasă superioară într-un tub nou. Precipitați ADN-ul prin adăugarea a 0,7 volume de izopropanol rece și incubați la -20°C timp de 15 minute.
  6. Centrifugați proba la 14.000 x g timp de 10 minute. Decantați supernatantul fără a deranja granulația și spălați ulterior cu 500 µl de etanol 70% rece ca gheața. Se decantează etanolul. Se îndepărtează etanolul rezidual prin uscare într-un SpeedVac.
  7. Se usucă peletul suficient de mult timp pentru a elimina alcoolul, dar fără a usca complet ADN-ul. Dizolvați ADN-ul în 20 µl de tampon TE (10 mM Tris, pH 8, 1 mM EDTA). Este posibil să fie necesară încălzirea peletului pentru a se dizolva.

Protocol opțional:

Utilizarea coloanelor de centrifugare din silice poate produce ADN de mai bună calitate. Pentru un protocol opțional, faceți clic aici.

.

Lasă un comentariu