Structura unei adenilciclaze de membrană legată de o proteină G stimulatoare activată

Adenilciclazele (AC) integrate în membrană sunt proteine cheie în transducția semnalelor la mamifere, răspunzând la o gamă largă de indicii extracelulare și intracelulare și generând adenozin monofosfat ciclic (AMPc) pentru o serie de evenimente de semnalizare în aval (1, 2). AC de membrană integrează mai multe cascade de semnalizare – de exemplu, făcând legătura între intrările de la receptorii cuplați cu proteina G (GPCR), modificările concentrațiilor intracelulare de Ca2+ (3) și cascadele de semnalizare a lipidelor (4). Există nouă subtipuri de AC la mamifere, clasificate ca AC1 până la AC9 (5). Pe baza secvenței de aminoacizi, toate subtipurile AC împărtășesc aceeași arhitectură generală prezisă. Acestea sunt proteine membranare politropice, compuse din 12 elice transmembranare (TM) și cu terminații N și C citosolice. Primele șase domenii TM (TM1-TM6) ale polipeptidei AC sunt urmate de o regiune citosolică ce include un domeniu catalitic (C1a), urmat de un domeniu C1b, cea de-a doua regiune TM, fasciculul TM7-TM12, apoi un al doilea domeniu catalitic (C2a) și un domeniu C2b C-terminal. Porțiunile N- și C-terminale ale proteinelor sunt foarte variabile, în timp ce porțiunile cele mai conservate sunt domeniile C1a și C2a, care aparțin nucleotidilciclazelor din clasa III (5, 6). Cristalografia cu raze X a unui AC5C1/AC2C2 chimeric într-un complex cu subunitatea de proteină G stimulatoare Gαs (7, 8) a dezvăluit caracteristicile cheie ale mașinăriei catalitice a AC și a ajutat la formularea unui mecanism detaliat de producere a AMPc de către ACs dependente de proteina G (7, 8). Cu toate acestea, fiecare dintre AC de membrană de mamifere include elemente structurale suplimentare, cum ar fi domeniul de răspândire a membranei și domeniul elicoidal (HD), care sunt esențiale pentru asamblarea corectă a acestor proteine și pentru funcția lor enzimatică.

Cu clonarea primului AC de mamifere a apărut sugestia că AC ar putea semăna cu transportoarele (9). Primele studii ale AC-urilor din Paramecium au sugerat că porțiunea TM a proteinei ar putea avea o funcție de canal ionic (10). În concordanță cu funcția lor de canal, secvența porțiunii TM a AC din Paramecium este omoloagă cu cea a canalelor de potasiu pornit în tensiune (11). Prezența unui fascicul de elice TM politropică și a domeniului citosolic de legare a adenozinei 5′-trifosfatului (ATP) sugerează o similitudine structurală și funcțională superficială cu transportatorii ABC (ATP-binding cassette). Cu toate acestea, nu există o similitudine substanțială de secvență între AC și nici o proteină cunoscută de tip transportor sau de tip canal ionic. Studiile asupra AC-urilor micobacteriene și de mamifere au indicat un posibil rol al domeniilor TM în asamblarea corectă a enzimei (7, 12, 13). Cu toate acestea, rolul structural și funcțional al regiunii TM rămâne neclar.

AC9 este un subtip de ciclază exprimat în multe țesuturi, inclusiv în plămâni, creier și inimă (14, 15). Acesta a fost studiat pe larg împreună cu complexele proteinei de ancorare a A-kinazei (AKAP) (16). S-a propus ca AC9 să fie legată prin intermediul AKAP Yotiao de canalele de potasiu IKs, de proteina kinaza A, de fosfodiesterază PDE4D3 și de proteina fosfataza PP1 (17). AC9 a fost identificat ca o potențială țintă a medicamentelor în astm (5). rs2230739, un polimorfism al AC9 care duce la o mutație Ile772→Met, este asociat cu modificări ale răspunsului la corticosteroidul inhalat budesonidă (18). Într-un model canonic de activare a AC, forskolina se leagă de un situs alosteric adiacent situsului catalitic, ceea ce duce la activarea enzimei. Interacțiunea dintre AC și subunitatea Gαs într-o stare legată de guanozină 5′-trifosfat (GTP) conduce, de asemenea, la activarea AC, activarea maximă a AC fiind obținută în prezența atât a forskolinei, cât și a proteinei Gαs. Cu toate acestea, deși comparațiile de secvență cu alte AC arată că AC9 conține un situs alosteric și un raport anterior a sugerat că forskolina poate activa AC9 (14), mai multe studii au concluzionat că AC9 este insensibilă la forskolină, iar consensul în domeniu a fost că AC9 se află în propria sa categorie ca proteină insensibilă la forskolină (19, 20).

AC-urile au rămas mult timp o piesă lipsă în înțelegerea noastră a transducției semnalului, posibil din cauza dificultăților recunoscute în exprimarea și purificarea acestor proteine pentru studii biochimice și structurale (21). Pentru a umple această lacună, am determinat structura AC9 bovină în complex cu Gαs (AC9-Gαs) folosind microscopia crioelectronică (cryo-EM) și analiza particulelor unice.

Am exprimat și purificat AC9 bovină (fig. S1A) și am confirmat integritatea sa funcțională folosind teste de acumulare de AMPc (fig. 1, A până la C). Proteina purificată a catalizat conversia ATP în cAMP și a putut fi inhibată de MANT-GTP (2ʹ-/3ʹ-O-(Nʹ-metilantraniloil)guanozină-5ʹ-O-trifosfat), un analog inhibitor al substratului AC (Fig. 1B). Reconstituirea proteinei cu Gαs activat de GTPγS (fig. S1, B și C) a condus la o activare robustă a ciclazei (Fig. 1A). Testele privind capacitatea activatorului universal al AC, forskolina, de a activa AC9 in vitro au relevat o activare foarte slabă a AC9 la concentrații submilimolare (Fig. 1A). În schimb, forskolina a putut activa complexul AC9-Gαs cu o concentrație efectivă mediană (EC50) de 111 μM (Fig. 1A și tabelul S2). Astfel, deși atât forskolina, cât și subunitatea Gαs au fost capabile să activeze parțial proteina, activarea completă a putut fi atinsă numai prin combinarea celor doi agenți. Mai mult, așa cum era de așteptat de la un modulator alosteric al AC, forskolina a deplasat concentrația inhibitoare mediană (IC50) a analogului MANT-GTP, substratul AC9, spre concentrația cea mai mică (Fig. 1, B și C). Prin urmare, experimentele noastre in vitro folosind AC9 de lungime completă purificată și proteina Gαs arată în mod clar că forskolina acționează asupra complexului proteic AC9-Gαs ca un activator alosteric clasic.

Am pregătit grile crio-EM congelate și hidratate care conțin complexul AC9-Gαs în prezența MANT-GTP și forskolinei la concentrații (0,5 mM pentru fiecare ligand) care depășesc valorile IC50 și EC50 pentru acești doi compuși și le-am supus analizei crio-EM cu o singură particulă (fig. S2). Cel mai bun subset de particule a dus la o hartă de densitate corespunzătoare complexului complet al ciclazei și al subunității proteinei G, rafinată la o rezoluție de 3,4 Å (fig. 1D). Harta completă a densității, împreună cu hărțile obținute după rafinarea focalizată a părților membranare (fig. S3) și citosolice (fig. S3) ale complexului, ne-a permis să construim un model tridimensional (3D) complet al complexului AC9-Gαs (fig. 1E). Harta și modelul au evidențiat mai multe elemente-cheie ale complexului AC9-Gαs: (i) mănunchiul de 12 domenii TM al AC9, (ii) HD care leagă mănunchiul TM și domeniul catalitic al AC9 și (iii) domeniul catalitic al AC9, legat de subunitatea Gαs activată de GTPγS (Fig. 1, D și E, și fig. S6).

Domeniul TM al proteinei posedă o simetrie pseudo-duală, o caracteristică des întâlnită la transportatorii de solut din familia diviziunii de nodulare a rezistenței, ABC sau a facilitatorilor majori (Fig. 2, A-C). Elicele transmembranare TM1-TM6 și TM7-TM12 pot fi suprapuse cu o deviație medie pătratică (RMSD) de 3,4 Å pe 176 de reziduuri (Fig. 2D). Pseudosimetria internă susține ipoteza că AC-urile membranare de mamifere au apărut printr-un eveniment de duplicare genetică dintr-un sistem simplu, posibil similar cu cel al „semiciclazei” Cya/Rv1625c din Mycobacterium tuberculosis (12). Interfața dintre cele două jumătăți TM ale AC9 este formată de elicele TM1, TM4 și TM6 în „jumătatea” N-terminală a mănunchiului de domenii TM și TM7, TM10 și TM12 în porțiunea C-terminală a proteinei (Fig. 2, B și C). Clonarea primei gene AC de mamifere a fost însoțită de o sugestie că AC ar putea acționa ca transportatori, pe baza secvenței lor primare (9). Structura noastră nu relevă nicio cale evidentă de translocare putativă a solutului în cadrul mănunchiului de domenii TM, elicele TM ale AC9 fiind strâns unite. Deși o micelă de digitonină oferă probabil un mediu similar cu cel al stratului biliar lipidic, este posibil ca conformația elicelor TM în mediul fiziologic al membranei să fie diferită.

Elicele TM6 și TM12 ale AC9 se extind în citosol, formând HD-uri lungi de 40 de residue, denumite aici HD1 (incluzând elicele h1.1 și h2.1) și HD2 (elicele h2.1 și h2.2; Fig. 2, E și F). Această regiune este importantă pentru funcția AC-urilor și a guanililciclazelor la procariote și eucariote (12). Reziduurile de la Leu323 la Met333 din elicea h1.1 și de la Ile1022 la Leu1032 din elicea h2.1 formează o spirală clasică (Fig. 2F). Am descris anterior HD a Cya, un AC de membrană din Mycobacterium intracellulare, omolog al Rv1625c din M. tuberculosis (12). HD-ul AC9 prezintă unele diferențe față de Cya în ceea ce privește dispunerea relativă a regiunii centrale la limita cu domeniul catalitic (Fig. 2, E și F, și fig. S7, A și B). În M. intracellulare Cya, elicele scurte sunt strâns legate la terminația C a spiralei spiralate (fig. S7B). În schimb, spirala spiralată a AC9 se desface la capetele C-terminale ale h1.1 și h2.1 (fig. 2F, fig. S7B și fig. S8A). Această regiune a enzimei este critică pentru funcția AC-urilor și a guanililciclazelor. Mutațiile genetice legate de boală sunt localizate la HD-urile AC5 în dischinezia familială și miokimia facială (22, 23) și la cele ale guanililciclazei retiniene (retGC1) în amauroza congenitală Leber-1 (24) și în distrofia conică a tijei-6 (CORD6) (25). Putem acum să precizăm pozițiile mutațiilor legate de boală folosind structura AC9 bovină, o aproximare mult mai apropiată de nucleotidilciclazele umane legate de patologie în comparație cu Cya din M. intracellulare.

Funcția fasciculului 12-TM în AC de mamifere a fost neclară. Studii recente la Rv1625c micobacterian au sugerat o posibilă funcție de receptor pentru regiunea care se întinde pe membrană a omologului micobacterian (12). Nu am putut rezolva părți ale suprafeței extracelulare a AC9 (Fig. 2, A și B) și nu este clar dacă partea membranară a proteinei adăpostește situsuri de legare relevante din punct de vedere funcțional pentru liganzi ipotetici. În mod similar, domeniul C1b care leagă domeniul catalitic C1a de TM7 nu a putut fi rezolvat în reconstrucția noastră (fig. S6, E-G). Cu toate acestea, structura noastră oferă indicii cu privire la modul în care interacțiunile cu regiunea care se întinde pe membrană ar putea influența funcția catalitică a proteinei. Elicele TM6 și TM12 sunt continue cu h1.1 și h2.1 în HD. TM6 și TM12 sunt situate la interfața pachetelor elicoidale TM1-TM6 și TM7-TM12 și sunt expuse lateral la bistratul lipidic (fig. 2E și fig. S8B). Este de conceput că interacțiunile directe ale TM6 sau TM12 cu lipidele, moleculele mici sau alte proteine ar putea influența direct domeniul catalitic prin modificarea orientării elicelor h1.1 și h2.1 (fig. S8B).

Domeniul catalitic complet al AC9 este compus din două jumătăți, C1a și C2a (fig. 1E și 3A), similar cu structurile cu raze X rezolvate anterior ale domeniilor solubile ale AC-urilor membranare (fig. S7, A și C). Așa cum s-a arătat anterior, principala interfață de interacțiune dintre subunitatea α a proteinei G și domeniul catalitic AC9 este formată prin inserția elicei Gαs Switch II în șanțul format de elicele α′2 și α′3 ale domeniului C2a al AC9 (fig. S7, D până la F). Regiunea HD h1.2 (reziduurile 340 – 360) se află în apropierea suprafeței de interacțiune cu Gαs (fig. S7E). Această regiune a proteinei pare a fi foarte dinamică și nu am putut rezolva reziduurile care leagă His361 și Pro384 din AC9 (fig. S7E). Cu toate acestea, apropierea acestei regiuni de interfața dintre proteina G și AC sugerează că acest element al structurii AC9 contribuie probabil la interacțiunea dintre AC9 și Gαs.

A fost detectat un element de densitate puternică localizat în interiorul situsului de legare a ATP și a situsului de forskolină (fig. 3, A și B, și fig. S9, A până la C). Această densitate a prezentat o asemănare superficială cu densitatea MANT-GTP, dar nu a corespuns locației sale așteptate (Fig. 3A). Densitatea din situsul forskolinei părea să se suprapună cu poziția așteptată a forskolinei (Fig. 3A). O caracteristică similară a densității a fost prezentă în harta reconstruită din imaginile probei lipsite de forskolină (Fig. 3B și fig. S9B). Prin urmare, independent de prezența MANT-GTP și/sau a forskolinei, situsurile active și alosterice par a fi ocupate de o densitate în concordanță cu o peptidă (Fig. 3, A și B, și fig. S9, A și B). Clasificarea și rafinarea 3D focalizată a relevat o legătură între această densitate și regiunea C-terminală a domeniului C2a al AC9 (Fig. 3C și fig. S3 și S9C). Deși caracteristicile de densitate din această clasă 3D mai puțin populată (harta SOL-C, calculată cu doar 16 343 de particule) nu sunt suficient de puternice pentru a construi cu încredere un model proteic atomic, folosind densitatea disponibilă ca o constrângere, am putut să o atribuim reziduurilor Cys1246 până la Pro1275 din terminalul C al AC9, sau domeniul C2b (Fig. 3C și fig. S9C). Calitatea ridicată a densității din interiorul situsului alosteric și al situsului activ (Fig. 3A și fig. S9, A și D) ne-a permis să construim modelul peptidei de ocluzie, care corespunde reziduurilor Ile1263 până la Pro1275 din domeniul C2b al AC9 (fig. S9D). Această regiune este foarte bine conservată între omologii AC9 de la vertebrate (fig. S9E), dar nu și în celelalte izoforme AC (AC1 până la AC8) (fig. S10).

Pentru a determina rolul funcțional al domeniului C2b în AC9, am comparat proprietățile enzimatice ale proteinei de tip sălbatic și ale proteinei trunchiate lipsite de domeniul C2b AC91250 (fig. 3D și fig. S11A). Cele două construcții au arătat o capacitate comparabilă de a converti ATP în cAMP, cu valori similare ale constantei Michaelis (Km) și Vmax (Fig. 3E și tabelul S2). AC91250 a fost activat de forskolină și inhibat de MANT-GTP într-un mod similar cu cel al AC9 (fig. S11, B-D). Adăugarea de Gαs a stimulat puternic producția de AMPc de către AC9 (fig. 3F), cu o creștere concomitentă a Km-ului său pentru ATP. În concordanță cu coada care inhibă legarea ATP, AC91250 a prezentat un Vmax ridicat, dar la o valoare mult mai mică a Km (Fig. 3F). Aceasta este o indicație puternică a faptului că regiunea C2b joacă un rol funcțional în starea de legare la proteina G a AC9. Îndepărtarea regiunii C2b crește afinitatea AC9 pentru ATP în prezența Gαs, permițând proteinei să atingă o rată maximă de cataliză la concentrații de ATP mult mai mici. Reducerea afinității pentru substrat (ATP) prin ocluzia situsului activ de către domeniul C2b poate reprezenta un mecanism de reglare pentru controlul producției de AMPc de către AC9 legată de proteina G.

Pentru a evalua modificările conformaționale în starea de ocluzie a AC9, am determinat structura crio-EM a complexului AC91250-Gαs în prezența de MANT-GTP și forskolină (AC91250-Gαs-MF; Fig. 3, G și H, și fig. S12 și S13). Reconstrucția la o rezoluție de 4,2Å ne-a permis să rezolvăm în mod clar densitatea pentru MANT-GTP și forskolina legate la situsurile lor canonice de legare (fig. 3, G și H, și 4; fig. S13, E la G). Compararea aranjamentului domeniului catalitic al complexelor AC91250-Gαs-MF și AC9-Gas a evidențiat o mică rearanjare relativă a C1a dependentă de prezența peptidei de ocluzie în situsurile active și alosterice (Fig. 4, A și B); RMSD între atomii domeniilor C1a mobile (de la Ile1380 la Gln574) din cele două structuri comparate aliniate folosind domeniile C2a ale acestora (de la Gln1049 la Lys1245) este de 1,9 Å. Mișcarea subtilă a întregului domeniu observată în starea de ocluzie a AC9 deplasează reziduurile de aminoacizi din C1a implicate în legarea nucleotidelor cu ~3 Å (fig. S13H). Prin urmare, domeniul catalitic central al AC9 adoptă o conformație ocluzivă, peptida derivată din C2b ocupând situsurile active și alosterice ale proteinei (fig. S9, D și E), concomitent cu o distorsiune a situsului activ în comparație cu cea observată în starea legată de MANT-GTP și forskolină.

Structura complexului AC9-Gαs într-o conformație ocluzivă ne-a permis să revizuim modelul stabilit de transducție a semnalului bazat pe AMPc (7, 26) (fig. S14). Activarea cascadei GPCR trebuie să conducă la formarea formei de AC legată de subunitatea Gαs pentru a genera AMPc. Cu toate acestea, starea de ocluzie descrisă aici adaugă un intermediar care nu a fost apreciat anterior. Starea ocluzată și starea activă a AC9 există probabil într-un echilibru; proba care a produs reconstrucția stării ocluzată poate fi activată de proteina G și poate produce AMPc. Km substanțial redus al proteinei pentru ATP (Fig. 3F) sugerează, de asemenea, că ocluzia situsului ATP poate fi favorizată în prezența proteinei G. Experimentele viitoare vor ajuta la definirea rolului funcțional al acestei conformații a proteinei în ciclul catalitic al AC9.

Arhitectura AC9 dezvăluită în acest studiu oferă indicii cu privire la rolul posibil al părților încorporate în membrană în AC-urile mamiferelor. O funcție aparentă a domeniului membranar este aceea de a permite asamblarea corectă a ciclazei active. Acest lucru este realizat de TM6 și TM12 care asigură cadrul pentru HD. Este probabil ca elementele proteinei care nu pot fi rezolvate în prezent, și anume, terminația N și domeniul C1b, să contribuie la asamblarea și reglarea funcției de ciclază a AC9 (fig. S6, E-G). Prin urmare, în ciuda separării domeniului catalitic cu ~40 Å de bistratul lipidic, este de conceput că porțiunea membranară a proteinei poate influența domeniul catalitic prin intermediul HD și al regiunilor de buclă adiacente acestuia.

Starea de ocluzie a complexului cu peptida C-terminală care leagă atât situsul activ, cât și situsul alosteric al AC9 poate reprezenta un mecanism autoreglementator important încorporat în mecanismul de transducție a semnalului bazat pe AC. Prezența peptidei poate ajuta la explicarea observațiilor inconsecvente privind insensibilitatea la forskolină a AC9 (14, 19, 20), susținând autoreglarea dependentă de context a AC9. Forskolină este un activator cu moleculă mică, derivat din plante, al AC; s-a postulat că există activatorul sau inhibitorul natural al acestui situs din AC (20), dar până în prezent nu a fost identificat. În cazul AC9, putem arăta acum că (i) forskolina este capabilă să activeze enzima și (ii) regulatorul natural probabil al situsului alosteric este porțiunea din domeniul C2b care se leagă de regiunea activă a proteinei. Sugerăm că, după activarea de către proteina G (fig. S14, de la A la D), C2b oclude centrul de reacție AC9 și blochează activitatea enzimatică, împiedicând producerea excesivă de AMPc în celulă (fig. S14E). Acest lucru este în concordanță cu un raport recent privind funcția autoinhibitorie a domeniului C2b al AC9 într-un context celular (27). Descoperirile noastre pot contribui la deschiderea drumului spre generarea de noi abordări în descoperirea de medicamente care să exploateze mecanismul molecular autoreglementator dezvăluit de structura AC9-Gαs.

.