mai 12, 2018
O întrebare frecventă pe care oamenii de știință și-o pun întotdeauna atunci când primesc semnalul de la un test bazat pe anticorpi este: „Acest semnal reprezintă în mod real prezența și cantitatea proteinei mele?”
Specificitatea anticorpilor este întotdeauna o preocupare pentru oamenii de știință. Chiar dacă există o serie de metode de validare care au fost utilizate pentru testarea specificității, datele sunt adesea suprainterpretate. Datele de cercetare de la diverse grupuri au arătat că uniianticorpi monoclonali utilizați pe piață nu sunt de fapt monospecifici. Aceștia pot reacționa încrucișat cu alte proteine.Iar reactivitatea încrucișată poate induce în eroare cercetătorii cu rezultate fals pozitive și poate provoca efecte secundare neașteptate și rapoarte de diagnosticare false pentru clinicieni.
Atunci care sunt controalele pe care ar trebui să le folosim pentru validarea specificității anticorpilor?
Liniile celulare și țesuturile care exprimă proteinele țintă în cantități mari pot fi folosite ca și controale pozitive pentru validarea anticorpilor.Poate fi o proteină endogenă sau o proteină supraexprimată codificată de o clonă de ADNc. Cu toate acestea, controlul pozitiv nu va putea confirma specificitatea anticorpului. Puteți vedea o bandă la dimensiunea corectă sau o colorare pozitivă în locația subcelulară corectă, dar toate acestea ar putea fi semnale fals pozitive din cauza reactivității încrucișate a anticorpilor. Deci, în mod normal, pentru validarea anticorpilor, este necesar un control negativ pentru evaluarea legăturii nespecifice.
Validarea knockout este până în prezent cel mai bun control negativ pentru evaluarea specificității anticorpilor. În validarea knockout,anticorpul este testat pe o linie celulară knockout care nu exprimă proteina țintă. Începând din 2017, OriGene s-a asociat cu EdiGene, un inovator CRISPR, pentru a produce celule dublu-knockout într-o manieră de mare randament. Spre deosebire de linia celulară knockout de la Horizon, liniile celulare knockout OriGene provin din linii celulare utilizate în mod obișnuit, cum ar fi HEK293T sau HeLa, ceea ce face ca produsul să fie mai relevant pentru cercetători. în această linie celulară dublu knockout, ținta anticorpului nu este prezentă deoarece gena care codifică proteina este eliminată sau „knock out”. Probele din celulele knockout și din celulele parentale (de tip sălbatic) sunt testate una lângă alta în raport cu același anticorp, iar dacă anticorpul este cu adevărat specific, ar trebui să detecteze semnalul specific doar în celulele de tip sălbatic, dar nu și în linia celulară knockout. Cu ajutorul lisatelor din aceste celule knockout, am validat peste 100 de anticorpi monoclonali (anticorpi validați KO). Se consideră că validarea Knockout oferă un adevărat control negativ pentru testarea specificității anticorpilor.
Dar este validarea Knockout suficientă pentru a confirma monospecificitatea unui anticorp? Aș susține această concluzie cu prudență.În primul rând, efectele în afara țintei ale celulelor knockout nu sunt bine studiate în acest stadiu. Așadar, s-ar putea ca o celulă knockout să elimine nu numai expresia proteinei care vă interesează, ci și să elimine sau să reducă expresia unei alte proteine, care ar putea fi o proteină cu reacție încrucișată cu anticorpul. Astfel, semnalul negativ nu înseamnă întotdeauna că anticorpul nu va reacționa cu alte proteine, cu excepția proteinei de interes. În al doilea rând, testarea cu celule/țesuturi knockout este posibilă numai pentru proteinele neesențiale. Pentru proteinele esențiale, knockout-ul este imposibil. Deci, pentru aceste proteine, veți avea nevoie de o altă modalitate de a testa specificitatea anticorpului.
Cu câțiva ani în urmă, OriGene a dezvoltat o metodă de matrice proteică pentru testarea specificității anticorpilor. Cu cea mai mare colecție de lizate de supraexprimare din lume, am realizat un proteinchip unic care conține >10k proteine umane supraexprimate în dublu exemplar pe o singură lamă de sticlă acoperită cu nitroceluloză. Această tehnologie proteinmicroarray a fost utilizată pentru a valida specificitatea multor anticorpi monoclonali OriGeneUltraMAB™. Prin creșterea numărului de proteine de pe cip, reactivitatea încrucișată a unui anticorp poate fi studiată în continuare la nivelul întregului proteazom uman.
În concluzie, testarea specificității anticorpilor este destul de complicată. Trebuie validat prin mai multe instrumente și direcții. pe măsură ce tehnologia continuă să avanseze, vom avea mai multe atuuri valoroase și proceduri standardizate pentru validarea anticorpilor. oamenii de știință nu se vor mai confrunta cu aceeași întrebare atunci când obțin semnale pozitive de la testele lor bazate pe anticorpi.