Variații în ciclul Calvin-Benson: presiuni de selecție și optimizare?

Ciclul Calvin-Benson este baza fixării carbonului în toate organismele fotosintetice. Cu toate acestea, se cunosc relativ puține lucruri despre măsura în care funcționarea sa variază între specii. Folosind o abordare de profilare a metaboliților, am descoperit diferențe în ceea ce privește nivelurile de intermediari cheie ai ciclului Calvin-Benson între speciile C3 și C4. Aceste diferențe în bazinele de metaboliți au fost observate între speciile C3, precum și între plantele C3 și C4. Această lucrare ridică posibilitatea interesantă ca presiunile de selecție diferite asupra componentelor ciclului Calvin-Benson să fi condus la optimizarea independentă a acestuia între specii.

În 1954, Melvin Calvin, Andrew Benson și James Bassham au publicat calea metabolică utilizată pentru fixarea CO2 atmosferic – ciclul Calvin-Benson (Bassham et al., 1954). Descoperirile lor fundamentale s-au bazat pe hrănirea algei Chlorella cu CO2 marcat cu 14C și urmărirea marcării metaboliților în timp (Bassham et al., 1954; Sharkey 2018). Aceștia au descoperit că ciclul este compus din trei faze: în primul rând, enzima ribulose-1,5-bisfosfat carboxilază/oxigenaza (Rubisco) fixează CO2 folosind ribulose-1,5-bisfosfat (RuBP) ca acceptor, producând două molecule de 3 carbon, 3-fosfoglicerat (3-PGA). În al doilea rând, ATP și NADPH generate în timpul lanțului fotosintetic de transport al electronilor (reacțiile fotosintezei dependente de lumină) sunt utilizate pentru a fosforila și, ulterior, a reduce 3-PGA la trioză fosfat (trioză-P). În al treilea rând, acceptorul de CO2 RuBP este regenerat printr-o serie de reacții (Caseta 1). Majoritatea enzimelor implicate în acest ciclu au fost descoperite mai devreme sau la scurt timp după aceea (Horecker et al. 1951; Racker et al., 1953; Mayoudan et al., 1957). De atunci, s-a presupus, în general, că funcționarea ciclului Calvin-Benson este foarte conservată între diferitele specii de plante.

Caseta 1.

Ciclul Calvin-Benson

Ciclul Calvin-Benson este compus din trei faze: (1) fixarea carbonului, (2) reducerea și (3) regenerarea acceptorului de CO2.

Carboxilarea se realizează prin intermediul ribulose-1,5-bisfosfat carboxilaza/oxigenaza (Rubisco), care fixează CO2 folosind ribulose-1,5-bisfosfat (RuBP) ca acceptor și, în acest fel, produce două molecule cu 3 atomi de carbon de 3-fosfoglicerat (3-PGA). Ulterior, 3-PGA este fosforilat de către fosfoglicerat kinaza (PGK) și redus la trioză fosfat (trioză-P) de către gliceraldehida-3-fosfat dehidrogenază (GAPDH) în faza de reducere. Ciclul utilizează 3 ATP și 2 NADPH pentru fiecare moleculă de CO2 fixat. Trioza-P poate fi transportată în afara cloroplastului pentru a produce zaharoză în citosol. Fructoza 1,6-bisfosfat aldolază (FBP ald) poate transforma trioza-P în fructoză-6-fosfat (F6P), intermediarul utilizat pentru producerea amidonului. De asemenea, trioza-P poate fi transformată în RuBP într-o serie de reacții de regenerare pentru a fixa mai multe molecule de CO2.

Abbreviații: fructoză-1,6-bisfosfat (FBP), fructoză-1,6-bisfosfatază (FBPază), eritroză-4-fosfat (E4P), sedoheptuloză 1,7-bisfosfat aldolază (SBP ald), sedoheptuloză-1,7-bisfosfat (SBP), sedoheptuloză-1,7-bisfosfat (SBP), sedoheptuloză-1,7-bisfosfatază (SBPază), sedoheptuloză-7-fosfat (S7P), transcetolază (TK), riboză-5-fosfat (R5P), xiluloză-5-fosfat (Xu5P), riboză-5-fosfat izomerază (RPI), riboză-5-fosfat epimerază (RPE), riboză-5-fosfat (Ru5P), fosforibulokinază (PRK). Enzimele care catalizează reacții ireversibile sunt evidențiate cu o săgeată îngroșată și îngroșată (de exemplu, Rubisco, FBPază, SBPază și PRK).

În marea majoritate a plantelor terestre, împreună cu reacțiile fotosintezei dependente de lumină, ciclul Calvin-Benson se desfășoară în principal în celulele mezofile ale frunzelor. Cu toate acestea, Rubisco discriminează slab între CO2 și O2 (Bowes et al., 1971) și fixarea unei molecule de O2 în loc de CO2 are ca rezultat fotorespirația – o cale de salvare costisitoare din punct de vedere energetic pentru a recupera RuBP. După ce concentrația atmosferică de CO2 a scăzut dramatic acum 2,3 miliarde de ani (Bekker et al., 2004), au evoluat două mecanisme de concentrare a carbonului, limitând cantitatea de fotorespirație. Aceste modificări ale procesului fotosintetic de bază, fotosinteza C4 și metabolismul acid crassulacean (CAM), au apărut fiecare de mai multe ori (Sage et al., 2011). Fotosinteza C4 implică separarea spațială a fotosintezei, astfel încât componentele reacțiilor dependente de lumină și ale ciclului Calvin-Benson să aibă loc în celulele mezofilului și ale tecii fasciculului (caseta 2). În ciuda diferențelor în ceea ce privește localizarea anatomică a fixării carbonului, până acum se știau puține lucruri despre modul în care funcționarea ciclului Calvin-Benson poate fi diferită la plantele C4 față de C3 și, de asemenea, între plantele C3.

Caseta 2.

Mecanismul de concentrare a carbonului la plantele C4

În 1966, Hal Hatch și Roger Slack au descoperit fotosinteza C4 (Hatch și Slack, 1966), care implică un mecanism de concentrare a carbonului adăugat la calea obișnuită de fixare a carbonului C3. Aceștia au folosit marcarea cu 14C pentru a demonstra că, în frunzele de trestie de zahăr, CO2 a fost mai întâi fixat într-un acid cu 4 atomi de carbon, mai degrabă decât în 3-fosfoglicerat (3-PGA), ca la plantele C3. Plantele C4 folosesc fosfoenolpiruvatul carboxilază (PEPC) ca enzimă inițială de fixare a carbonului în celulele mezofile. Acidul cu 4 atomi de carbon (malat sau aspartat, în funcție de tipul de fotosinteză C4) produs în celulele mezofile intră apoi în celulele tecii fasciculului, unde este decarboxilat și se eliberează CO2. Acest mecanism de concentrare a carbonului îi permite lui Rubisco să acționeze aproape exclusiv ca o carboxilază în timpul ciclului Calvin-Benson în celulele tecii fasciculului. Pe lângă o reconfigurare a enzimelor metabolice existente, calea C4 necesită dezvoltarea unei anatomii specializate a frunzelor (anatomia Kranz), care include o creștere a distanței dintre nervuri și a dimensiunii celulelor tecii fasciculului. În mod clasic, au fost recunoscute trei tipuri diferite de fotosinteză C4, denumite după enzima primară responsabilă de reacția de decarboxilare în celulele tecii fasciculului: NAD-ME, NADP-ME sau tipul PEPCK. Abrevieri: anhidrază carbonică (CA), oxaloacetat (OA), malat dehidrogenază dependentă de NADP (NADP-MDH), malat (M), enzimă malică dependentă de NADP (NADP-ME), piruvat (Pyr), piruvat,ortofosfat dikinază (PPDK), fosfoenolpiruvat (PEP).

Variația metaboliților ciclului Calvin-Benson între specii

Ciclul Calvin-Benson este, fără îndoială, una dintre cele mai critice căi biochimice de pe pământ, fiind calea de asimilare a carbonului la plante – inima fotosintezei. Dar oare toate speciile de plante parcurg această cale în același mod? Arrivault et al. (2019) au profilat abundența metaboliților ciclului Calvin-Benson de la cinci plante C3 (inclusiv Arabidopsis și mai multe culturi importante, cum ar fi orezul, grâul și maniocul) și patru plante C4 (inclusiv porumbul). Metaboliții totali au fost extrași din frunzele mature și măsurați cu ajutorul cromatografiei lichide în fază inversă cuplată la spectrometria de masă în tandem (LC-MS/MS). Pentru o cuantificare fiabilă, probele au fost îmbogățite cu standarde interne de metaboliți marcați cu izotopi; 3-PGA a fost cuantificat enzimatic. Profilele de metaboliți ale diferitelor specii de plante au fost comparate folosind analiza componentelor principale.

În mod surprinzător, Arrivault et al. (2019) au descoperit diferențe substanțiale în profilurile de metaboliți ai intermediarilor ciclului Calvin-Benson între cele cinci specii C3 pe care le-au studiat. Intermediarii care au variat cel mai mult au inclus nivelurile absolute de 3-PGA, trioză-P, riboză-5-fosfat (Ru5P) și xiluloză-5-fosfat (Xu5P). Nivelurile relative de RuBP în comparație cu nivelurile de intermediari implicați în regenerarea RuBP au fost variabile între specii. În plus, autorii au demonstrat variabilitatea nivelurilor relative ale perechilor de metaboliți, cum ar fi fructoza-1,6-bisfosfat (FBP) și fructoza-6-fosfat (F6P), care sunt legate prin reacția ireversibilă a FBPazei; și a perechii de metaboliți sedoheptuloză-1,7-bisfosfat (SBP) și sedoheptuloză-7-fosfat (S7P), care sunt interconvertite ireversibil de SBPază. În majoritatea cazurilor, cele cinci specii C3 s-au separat clar unele de altele în analiza componentelor principale. Măsura în care acestea s-au separat a depins de faptul că datele au fost normalizate în funcție de greutatea proaspătă, de conținutul de clorofilă sau de conținutul de proteine. Variația acestor intermediari în cadrul celor cinci specii C3 indică diferențe în modul în care plantele execută aceeași cale de fixare a carbonului. Aceste informații au consecințe pentru strategiile care vizează îmbunătățirea fotosintezei. De exemplu, SBPase poate limita rata de fotosinteză (Zhu et al., 2007), iar supraexprimarea poate crește eficiența fotosintetică (Lefebvre et al., 2005; Feng et al. 2007; Ding et al., 2016; Driever et al., 2017). Astfel, modificarea activității unei singure enzime din ciclul Calvin-Benson poate avea un impact asupra ratei de fotosinteză și, ulterior, asupra biomasei și randamentului. Cu toate acestea, se știe că eficacitatea acestei abordări variază de la o specie la alta. Variația preexistentă a nivelurilor de metaboliți SBP și S7P între speciile C3 raportate de Arrivault et al. (2019) este, prin urmare, importantă și poate oferi o perspectivă asupra răspunsului variabil al fotosintezei la creșterea cantităților de SBPază.

Din moment ce mecanismul de concentrare a carbonului din plantele C4 limitează fotorespirația, a fost poate mai puțin surprinzător faptul că primul produs al fotorespirației, 2-fosfoglicolatul (2-PG), a fost mai puțin abundent în speciile C4 decât în speciile C3. Mai mult, plantele C4 au avut niveluri mai scăzute de RuBP decât plantele C3, în concordanță cu investiția lor mai mică în Rubisco. Cu toate acestea, chiar și atunci când nivelurile de 2-PG și RuBP au fost omise din setul de date, nivelurile de metaboliți C3 și C4 s-au separat aproape întotdeauna în analiza componentelor principale. Aceste diferențe au fost consecvente, indiferent dacă datele au fost normalizate în funcție de greutatea proaspătă, de conținutul de clorofilă sau de conținutul de proteine, astfel încât modificările indică faptul că enzimele responsabile de generarea metaboliților efectuează cataliză la rate diferite în diferite specii. Autorii au inventat termenul de „mod de funcționare” al ciclului Calvin-Benson pentru a descrie aceste diferențe – astfel încât ciclul funcționează diferit de la o specie la alta, chiar dacă sunt implicate aceleași enzime, ceea ce duce la modificările observate în nivelurile relative ale intermediarilor. Prin urmare, ei propun că diferențele în ciclul Calvin-Benson între plantele C3 și C4 sunt mai largi decât o simplă relocalizare spațială în celulele tecii fasciculului la cele din urmă, și implică o adaptare în modul de funcționare a ciclului.

Perspective viitoare

Estabilirea faptului că modul de funcționare a ciclului Calvin-Benson poate varia este interesantă, mai ales având în vedere că structura căii (în ceea ce privește enzimele implicate și secvența lor de reacție în cadrul ciclului) a fost foarte bine conservată. Cu toate acestea, de-a lungul milioanelor de ani de la prima apariție a ciclului, raportul dintre O2 și CO2 din atmosferă s-a schimbat dramatic. Se crede că aceste schimbări au contribuit la evoluția unor specii de plante care au dezvoltat mecanisme de concentrare a carbonului. Autorii propun acum că nivelurile scăzute de CO2, în combinație cu condiții de mediu specifice, ar fi putut duce la dezvoltarea unor moduri diferite de funcționare a ciclului Calvin-Benson. Astfel, variația profilurilor de metaboliți observată ar putea reflecta presiuni de selecție distincte asupra modului în care este reglementat ciclul Calvin-Benson în diferite neamuri de plante. Abordarea utilizată de autori pentru a analiza intermediarii ciclului Calvin-Benson ar putea fi aplicată acum la mai multe specii, iar acest lucru ar fi deosebit de interesant dacă acestea ar acoperi o gamă mai largă de familii de plante din medii diverse. Acest lucru ar putea dezvălui dacă variația urmează strict taxonilor filogenetici sau mediilor specifice la care s-au adaptat plantele.

De asemenea, plantele C4 analizate în Arrivault et al. realizează toate fotosinteza de tip NADP-ME din C4. Astfel, o linie promițătoare de studiu ulterior ar fi aceea de a explora dacă modificări similare în intermediarii ciclului Calvin-Benson sunt observate în toate cele trei tipuri de metabolism C4, sau dacă acestea sunt specifice tipului NADP-ME.

Această lucrare este un punct de plecare excelent pentru a descoperi modul în care aceste moduri diferite ale ciclului Calvin-Benson sunt controlate la nivel molecular. În timp ce profilarea metaboliților permite o abordare imparțială pentru a evalua variația nivelurilor de intermediari între diferite specii, cauzele care stau la baza acestor diferențe rămân a fi determinate. Variația dintre specii ar putea rezulta din diferențele de expresie genetică și din activitățile proteice ulterioare, din variația secvenței de aminoacizi care are un impact asupra cineticii sau din reglarea post-translațională a enzimelor. În special, aproape toate enzimele ciclului Calvin-Benson sunt supuse cel puțin unei forme de reglare redox, în principal prin intermediul sistemului tioredoxină (TRX)/ferredoxină (Fd) (Buchanan și Palmer, 2005; Michelet et al. 2013). Integrarea acestor date privind transcrierea, abundența proteinelor și activitatea enzimatică la nivelul metaboliților poate dezvălui baza moleculară a variației. Mai mult, variațiile observate în rezervele de metaboliți pot fi, de asemenea, legate de cererile pentru anumiți intermediari, în special cei care sunt retrași din ciclul Calvin-Benson. De exemplu, fluxul prin ciclu poate fi influențat de căile de ieșire pentru a permite sinteza amidonului (prin F6P), a zaharozei și a izoprenoidelor (prin trioză-P), a aminoacizilor prin calea shikimatului (prin E4P), precum și a tiaminei și a nucleotidelor (prin R5P) (Raines, 2011).

Arrivault et al. (2019) raportează variații interesante în modul în care funcționează componentele ciclului Calvin-Benson la diferite specii de plante. Acest lucru va cataliza cu siguranță studii suplimentare privind modul în care plantele au adaptat această cale fundamentală și veche de fixare a carbonului la diferite medii.

.