Abstract
I macrofagi svolgono un ruolo importante nella difesa dell’ospite, oltre alla potente capacità di fagocitare gli agenti patogeni o le sostanze estranee. Svolgono una varietà di ruoli nella regolazione immunitaria, nella guarigione delle ferite e nella conservazione dell’omeostasi dei tessuti. I macrofagi sono caratterizzati da un’elevata eterogeneità, che può polarizzarsi in almeno due estremi principali, i macrofagi di tipo M1 (attivazione classica) che sono normalmente derivati dai monociti e i macrofagi di tipo M2 (attivazione alternativa) che sono principalmente i macrofagi residenti nei tessuti. Sulla base del processo di guarigione delle ferite nella pelle, gli studi precedenti hanno documentato come questi diversi sottotipi di macrofagi partecipano alla riparazione e al rimodellamento dei tessuti, mentre il meccanismo dei macrofagi nella guarigione delle anastomosi intestinali non è ancora stato stabilito. Questa revisione riassume le prove attualmente disponibili riguardo ai diversi ruoli dei macrofagi polarizzati nel corso fisiologico della guarigione anastomotica e i loro ruoli patologici nella perdita anastomotica, la complicazione più pericolosa dopo la chirurgia gastrointestinale.
1. Introduzione
I macrofagi sono cellule immunitarie mieloidi che svolgono un ruolo centrale nell’infiammazione e nella difesa dell’ospite. Queste cellule sono caratterizzate dalla potente capacità di fagocitosi e sono accreditate di proteggere l’ospite dalle infezioni attraverso un processo cosiddetto “immunità innata”. Negli ultimi anni, con l’accumulo di prove, i macrofagi sono emersi come una delle cellule più versatili. I loro ruoli si sono spostati da cellule effettrici immunitarie che conducono la difesa dell’ospite solo come “spazzini” a predominanti “direttori” ed “esecutori” per regolare la risposta infiammatoria, mantenere l’omeostasi dei tessuti, partecipare alla guarigione delle ferite e al rimodellamento dei tessuti .
I macrofagi sono attivamente coinvolti nel processo di guarigione delle ferite, mentre il loro ruolo in una speciale ferita chirurgica, nota anche come ferita anastomotica, non è stato ancora completamente stabilito. L’anastomosi viene costruita dopo la rimozione del tumore gastrointestinale o la resezione dell’intestino dai chirurghi per ricostruire la continuazione del tratto gastrointestinale. Una guarigione anomala dell’anastomosi può svilupparsi in una perdita anastomotica (AL), definita come una perdita di contenuto luminale da una connessione intestinale chirurgica. È la complicazione più pericolosa dopo la chirurgia colorettale, perché è responsabile di un tasso di mortalità postoperatoria fino al 40%, di un’ospedalizzazione prolungata e di un aumento del costo dell’assistenza sanitaria dovuto al trattamento della sepsi e alla necessità di un nuovo intervento. Tuttavia, un meccanismo dettagliato a livello cellulare deve ancora essere stabilito a causa delle prove limitate. In questa rassegna, basandoci su popolazioni eterogenee di macrofagi e sulle loro opposte tendenze di polarizzazione, tendiamo a discutere i ruoli dei diversi tipi di macrofagi in una guarigione anastomotica senza problemi e i loro ruoli patologici nelle perdite anastomotiche.
1.1. Sottotipi di macrofagi
I macrofagi o fagociti mononucleari sono stati a lungo ritenuti originari delle cellule staminali ematopoietiche (HSC). Il dogma prevalente ha affermato che tutti i macrofagi derivavano da e venivano riforniti dai monociti. Tuttavia, le cellule della famiglia dei macrofagi (cellule del sistema fagocitario mononucleare) manifestano una notevole eterogeneità, sia nella loro morfologia che nelle funzioni biologiche. Questi dati recenti hanno messo in discussione la concezione a lungo sostenuta di “HSC-monociti-macrofagi”. È stato dimostrato che i macrofagi residenti nei tessuti, come le cellule di Kupffer del fegato, le cellule di Langerhans epidermiche della pelle e la microglia del cervello, derivano dal sacco vitellino e possono persistere nei topi adulti indipendentemente dalle CSE. Questi macrofagi residenti nei tessuti possono rinnovarsi in situ, anche se potrebbero anche essere reintegrati dai monociti del sangue in certe situazioni. In contrasto con i macrofagi derivati dai monociti che partecipano a un processo antibatterico durante la risposta infiammatoria acuta, i macrofagi residenti nei tessuti esprimono diverse proprietà funzionali e svolgono un ruolo centrale nel mantenimento dell’architettura dei tessuti, della funzione e dell’omeostasi, e il loro ruolo nella guarigione anastomotica è ulteriormente discusso di seguito.
La diversità e la plasticità sono stati riconosciuti come caratteristiche dei macrofagi, che contribuiscono alla loro significativa eterogeneità. In generale, la polarizzazione dei macrofagi può essere divisa in due grandi estremi, cioè l’attivazione classica che risulta in macrofagi di tipo M1 (M1) e l’attivazione alternativa che risulta in macrofagi di tipo M2 (M2). Questi due tipi di macrofagi eseguono diversi fenotipi funzionali in risposta a segnali microambientali, come prodotti microbici, cellule danneggiate e citochine dai linfociti attivati. In particolare, i ligandi dei recettori Toll-like (TLR) e l’interferone-γ (IFN-γ) possono indurre i macrofagi a polarizzarsi in macrofagi di tipo M1; al contrario, l’interleuchina-4 (IL-4) e l’interleuchina-13 (IL-13) inducono i macrofagi a polarizzarsi in macrofagi di tipo M2. Tuttavia, tale spiegazione potrebbe non illustrare completamente tutti i diversi scenari di attivazione. Murray et al. hanno proposto che ci dovrebbero essere alcuni altri sottotipi tra M1 e M2, compreso il sottogruppo M2a indotto da IL-4 e IL-13, il sottogruppo M2b attivato da immunocomplessi (TLR), e il sottogruppo M2c disattivato da glucocorticoidi, fattore di crescita trasformante (TGF), o interleuchina-10 (IL-10) . Inoltre, è stato anche riportato che ci potrebbe essere un sottotipo supplementare di M2 (M2d), che è suscitato da agonisti TLR e adenosina. Sembra che la polarizzazione dei macrofagi debba essere vista come uno spettro continuo, sul quale due tipi di macrofagi (M1 e M2) occupano le estremità opposte. Un’altra classificazione della polarizzazione proposta da Mosser e Edwards ha suggerito che i macrofagi sono attivati per formare tre popolazioni incaricate rispettivamente della difesa dell’ospite, della guarigione delle ferite e della regolazione immunitaria. Gli autori classificarono i macrofagi sulla base delle loro funzioni fondamentali piuttosto che degli stimoli. Corrispondendo alla concezione precedentemente discussa del paradigma “M1-M2”, la maggior parte dei macrofagi derivati dai monociti sono attivati classicamente ed esprimono il fenotipo M1, che esercita la difesa dell’ospite; al contrario, i macrofagi residenti nei tessuti sono principalmente attivati nel percorso alternativo che esprime la caratteristica M2-like e conserva l’omeostasi dei tessuti e la risoluzione dell’infiammazione. Il ruolo dei macrofagi polarizzati nella guarigione fisiologica delle anastomosi
La parete del tratto alimentare contiene quattro strati (cioè, mucosa, sottomucosa, muscularis propria e sierosa). Per una classica anastomosi intestinale invertita end-to-end, l’apposizione della sierosa annulla il divario tra le due estremità del tratto gastrointestinale, fornendo una barriera che isola la cavità addominale sterile dai contenuti luminali e dai batteri; inoltre, questo strato è importante nel fornire una matrice per i fibroblasti. La sottomucosa consiste di vasi sanguigni, linfatici e fibre nervose; questo strato è la fonte dei fibroblasti che diventano attivi dopo la chirurgia gastrointestinale e iniziano a depositare collagene. Le fibre di collagene pinzate o suturate in questo strato forniscono la maggior parte della forza di trazione dell’anastomosi; quindi, la sottomucosa è di grande importanza nella guarigione anastomotica. Lo strato mucoso gioca anche un ruolo nel mantenere l’omeostasi per permettere il processo di guarigione. Un pool di macrofagi nella mucosa gastrointestinale è il più grande pool di macrofagi tissutali nel corpo, e una lunga assenza o disfunzione dei macrofagi compromette la guarigione anastomotica.
La riparazione e la guarigione dei tessuti dopo una lesione sono state studiate per secoli ma rimangono comprese ad un oggetto limitato, cioè la pelle. A differenza di questo, la guarigione del tratto gastrointestinale è anatomicamente oscurata dall’ispezione, permettendo solo al chirurgo di giudicare il successo dell’operazione solo sui parametri di benessere generale del paziente. Ci sono alcune differenze tra la pelle e la guarigione anastomotica tra cui l’anatomia (ad esempio, nessuna componente anatomica equivalente della sierosa nei tessuti cutanei) e l’attività del collagene e della collagenasi . Tuttavia, la risposta classica alle lesioni si verifica in tutti gli organi e tessuti. Il corso fisiologico della guarigione dell’anastomosi può anche essere diviso in tre fasi sovrapposte ma distinte, che comprendono l’infiammazione, la formazione di nuovi tessuti e il rimodellamento (Figura 1) .
1.2.1. Infiammazione
Oltre all’infezione di diversi fattori microbici, le ferite o i traumi come i colpi chirurgici possono anche portare ad un’infiammazione non associata ad agenti patogeni, che può essere ulteriormente divisa in una risposta infiammatoria precoce e una tardiva. Nella fase infiammatoria precoce, i neutrofili vengono reclutati dal sangue circolante nel tessuto locale della ferita (l’area anastomotica). Queste cellule polimorfonucleate reclutate rimuovono le particelle estranee o i batteri locali e poi subiscono l’apoptosi o la necrosi. In seguito, i monociti vengono reclutati e si differenziano in macrofagi che sono altamente fagocitanti. Essi fagocitano i neutrofili compromessi e altri detriti tissutali per proteggere da ulteriori danni ai tessuti. Durante questa fase, in risposta ai pattern modificatori associati al patogeno (PAMPs) in una circostanza contaminante o ai pattern modificatori associati al danno (DAMPs) in una circostanza sterile, i macrofagi sono classicamente attivati ed esprimono il fenotipo M1. I macrofagi M1 rilasciano alte concentrazioni di citochine proinfiammatorie come il fattore di necrosi tumorale-α (TNF-α), l’interleuchina-1β (IL-1β), l’interleuchina-6 (IL-6) e l’interleuchina-12 (IL-12); proteasi e specie reattive dell’ossigeno (ROS), tutte ritenute importanti per l’uccisione microbica e la risposta proinflammatoria. I macrofagi M1 possono anche produrre collagenasi, un enzima ad alta attività che causa la degradazione del collagene che si traduce in una bassa forza anastomotica subito dopo la formazione di un’anastomosi. Nella fase tardiva dell’infiammazione, con un’eccessiva fagocitosi di neutrofili apoptotici, l’impegno delle integrine β2 sui macrofagi da parte dei neutrofili apoptotici attiva i macrofagi ad esprimere il mediatore antinfiammatorio transforming growth factor (TGF). Al contrario, la produzione di citochine proinfiammatorie come TNF-α e IL-1β è stata inibita. Così, il fenotipo dei macrofagi passa da proinfiammatorio M1-like a anti-infiammatorio M2-like. Questi macrofagi producono citochine come IL-10 e gettano le basi per la formazione di nuovi tessuti secernendo altri fattori di crescita come il fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF). Poiché i macrofagi stimolati con IL-10, TGF o glucocorticoidi in vitro si polarizzano nel sottotipo M2c che condivide somiglianze con i macrofagi antinfiammatori, ciò suggerisce che i macrofagi antinfiammatori appartengono ai macrofagi di tipo M2c e sono in grado di amplificare la loro risposta antinfiammatoria secernendo IL-10 e TGF in un ciclo feedforward. Inoltre, le capacità antinfiammatorie e rigenerative dei macrofagi antinfiammatori hanno dimostrato di essere interamente IL-10-dipendenti in ambienti sterili, per esempio, nella ferita chirurgica. Formazione di nuovi tessuti
In questa fase, i macrofagi residenti nei tessuti o reclutati dal sangue periferico, noti come macrofagi profibrotici, generano vari fattori di crescita come TGF, fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGF), fattore di crescita dei fibroblasti-2, o fattore di crescita insulino-simile-1 . Tra questi, il TGF è una citochina profibrotica che agisce sui fibroblasti e li attiva per differenziarsi in miofibroblasti nel tessuto della ferita. I miofibroblasti producono una massa di componenti della matrice extracellulare (ECM) tra cui collagene e fibronectina per riempire il difetto del tessuto. Nel tratto gastrointestinale, il collagene può essere prodotto anche dalle cellule muscolari lisce. I sottotipi di collagene nel tratto gastrointestinale sono i collageni I, III e V, rispetto ai soli collageni I e III della pelle. Grazie alle efficienti forze contrattili dei miofibroblasti, i tessuti fratturati della ferita possono essere legati insieme e ricostruire la loro integrità. Nel frattempo, i macrofagi profibrotici e i fibroblasti attivati rilasciano fattori proangiogenici come il VEGF, che stimolano le cellule progenitrici endoteliali a strisciare verso il tessuto della ferita, per promuovere la formazione di nuovi vasi (angiogenesi). L’invasione del capillare aumenta l’apporto di sangue ai tessuti locali e facilita la guarigione anastomotica. Inoltre, studi sulla mucosa colonica in via di guarigione dei conigli dopo un’escissione sperimentale hanno mostrato che un’abbondanza di cellule mesenchimali negli strati muscolari intestinali in via di guarigione accompagna l’invasione capillare; queste cellule possono differenziarsi in cellule muscolari lisce e istiociti, che si pensa siano responsabili del ripristino del tessuto muscolare liscio. I macrofagi profibrotici, i miofibroblasti e i neovasi costituiscono tutti insieme il tessuto di granulazione, il compartimento fondamentale più importante nel normale corso della guarigione delle ferite. Questi macrofagi profibrotici sono classificati funzionalmente come macrofagi M2a-like perché possono essere indotti in vitro da IL-4 e IL-13 . Tuttavia, non è chiaro se i macrofagi antinfiammatori e profibrotici possano essere chiaramente distinti in vivo, e sembra che la plasticità dei macrofagi crei una miscela o continui spostamenti di varianti durante la guarigione della ferita.
1.2.3. Rimodellamento
Il rimodellamento dell’anastomosi è un processo dinamico di maturazione all’interno del tessuto cicatrizzato che si basa su un equilibrio tra la deposizione e la rottura della ECM e il rimodellamento del tessuto. Una parte dei macrofagi residenti nel tessuto, denominati macrofagi fibrolitici, è fondamentale per mantenere questo equilibrio dinamico. Essi producono metalloproteinasi di matrice come la metalloproteinasi-2 (MMP2), la metalloproteinasi-9 (MMP9), la metalloproteinasi-12 (MMP12) e la metalloproteinasi-19 (MMP19), per degradare le macromolecole della matrice, cioè il collagene, uno dei componenti più importanti della ECM. La sottomucosa è uno strato di resistenza del tratto gastrointestinale e fatto prevalentemente di collagene, e il rimodellamento di questo strato predomina la forza dell’anastomosi. A seconda delle MMP secrete dai macrofagi fibrolitici, le fibre di collagene inizialmente depositate vengono riorganizzate e reticolate, rimodellate da collagene di tipo III a collagene di tipo I; quest’ultimo è molto più forte. Inoltre, i macrofagi fibrolitici regolano anche la degradazione sintetizzando l’inibitore tissutale delle metalloproteinasi (TIMPs), che può inibire le attività delle MMPs. Inoltre, i macrofagi fibrolitici sono responsabili dell’induzione dell’apoptosi dei fibroblasti, della successiva rimozione delle cellule apoptotiche e della soppressione dell’ulteriore infiammazione tramite il rilascio di IL-10. I macrofagi fibrolitici sono proposti per essere classificati come macrofagi M2c-like che possono essere suscitati in vitro da cellule apoptotiche e IL-10.
Quindi, i macrofagi partecipano a tutti i corsi fisiologici della guarigione anastomotica. Tra le tre fasi principali della riparazione dei tessuti, i macrofagi esprimono diversi fenotipi durante le diverse fasi. Ci sono almeno quattro tipi di macrofagi in una condizione di normale riparazione dei tessuti: (1) macrofagi proinfiammatori, (2) macrofagi antinfiammatori, (3) macrofagi profibrotici e (4) macrofagi fibrolitici. Se ordiniamo questi quattro tipi di macrofagi secondo il paradigma “M1-M2”, i macrofagi proinfiammatori e profibrotici possono, rispettivamente, corrispondere ai macrofagi di tipo M1 e M2a. Nel frattempo, sia i macrofagi antinfiammatori che quelli fibrolitici appartengono probabilmente ai macrofagi di tipo M2c. Ruolo dei macrofagi nelle perdite anastomotiche
Come abbiamo discusso in precedenza nella nostra rassegna, la comparsa di AL contiene principalmente tre fattori: comunicazione, infezione e disturbi di guarigione. Per comunicazione si intende il difetto del tratto alimentare nella regione anastomotica che collega la lumina gastrointestinale e la cavità addominale. L’infezione indica un’infezione batterica del sito anastomotico. I disturbi di guarigione includono tutte le sostanze che disturbano il normale processo di guarigione come l’ipossia o l’infiammazione. Questi tre fattori interagiscono attivamente l’uno con l’altro: un fattore ha luogo, e una catena reattiva che consiste di tutti i fattori sarà avviata, portando infine alla AL. Per esempio, l’infezione provoca una risposta infiammatoria nel sito anastomotico, che compromette la deposizione di collagene, quindi interferisce con il normale processo di guarigione, e porta a una comunicazione tra le pareti gastrointestinali intra ed extraluminali. Al contrario, la comunicazione permette al contenuto dell’intestino (compresi i batteri) di dislocarsi nella cavità addominale, causa un’infezione intra-addominale, e in seguito ritarda la guarigione dell’anastomosi. Clinicamente, la comunicazione in una certa misura è considerata un risultato clinico macroscopico, mentre l’infezione e i disturbi di guarigione sono processi biologici duraturi. Per AL, i macrofagi sono principalmente coinvolti negli ultimi due meccanismi, cosa che si osserva anche in altre ferite mal guarite.
L’infezione anastomotica può essere causata da una deiscenza anastomotica (perdita di contenuto intestinale nella cavità addominale sterile) o da una contaminazione pre-/intraoperatoria. Indipendentemente dalla causa dell’infezione, nell’ambiente infettivo contaminante, i macrofagi si polarizzano nel tipo M1 come detto sopra. Tuttavia, invece di sostenere la resistenza ai batteri intracellulari e controllare la fase acuta dell’infezione, un programma M1 eccessivo o prolungato è deleterio per i pazienti, come dimostrato nelle infezioni acute con Escherichia coli. E. coli come flora residente dell’intestino può indurre un tipico profilo M1 attraverso il riconoscimento dei lipopolisaccaridi (LPS) da TLR4. I macrofagi classici attivati di tipo M1 aumentano l’espressione dell’ossido nitrico sintasi inducibile (iNOS), che è responsabile della generazione di ossido nitrico (NO). NO è stato prima identificato per mediare la vasodilatazione arteriosa e poi si è scoperto che ha un ruolo nella difesa dell’ospite contro gli agenti patogeni. Inoltre, è stato descritto un ruolo prominente di NO nella deposizione di collagene, nella fibrosi e nella formazione di cicatrici. Alti livelli di NO nella ferita, come nelle infezioni o nelle infiammazioni, compromettono gravemente la sintesi del collagene nella ferita. La diminuzione della deposizione di collagene indebolisce gravemente la forza anastomotica, che può portare al fallimento della guarigione anastomotica. Pertanto, la polarizzazione impropria M1 dei macrofagi nell’infezione batterica della cavità addominale contribuisce al verificarsi di AL.
Il ruolo dei macrofagi nelle perdite con disturbi di guarigione è più complicato. Durante una condizione normale, la riparazione dei tessuti inizia dalla clearance dei detriti tissutali e delle cellule morte, fagocitando in modo efficiente questi “rifiuti tissutali” da parte dei macrofagi, ed è fondamentale per la risoluzione tempestiva dell’infiammazione e il successo della guarigione. Tuttavia, per quei pazienti complicati dal diabete mellito, che avanzano negli anni, o sottoposti a chemioterapia, la capacità dei macrofagi di fagocitare è gravemente influenzata, il che porta direttamente a un accumulo di cellule apoptotiche o necrotiche nel sito dell’anastomosi. Questo accumulo di cellule morte prolunga la fase infiammatoria, disturba il processo di guarigione e compromette la risoluzione dell’infiammazione. Altri disturbi come l’ischemia o l’ipossia anastomotica compromettono gravemente la guarigione anastomotica. A livello cellulare, esporre i macrofagi a un ambiente anossico porta all’espressione di citochine proinfiammatorie come IL-1β e TNF-α e mediatori citotossici come NO, il che indica che l’ipossia può promuovere la polarizzazione dei macrofagi nel fenotipo M1. I macrofagi M1 eccessivamente attivati sostengono la risposta proinfiammatoria e ostacolano le fasi successive del processo di riparazione che influenza la corretta guarigione e il rimodellamento dell’anastomosi, e il relativo meccanismo è descritto sopra.
In base alle prove disponibili, sembra che i macrofagi attivati classici che esprimono il fenotipo M1 siano responsabili del processo patologico di guarigione anastomotica difettosa, mentre i macrofagi attivati alternativi che esprimono il fenotipo M2 svolgono un ruolo critico nella risoluzione dell’infiammazione e nella riparazione riuscita del tessuto (Figura 2). Anche se i macrofagi di tipo M1 partecipano alla fase iniziale della normale guarigione delle ferite, la trasformazione programmata del loro orientamento polarizzato da M1 a M2 pone le basi della risposta infiammatoria transitoria e della successiva rigenerazione dei tessuti.
2. Conclusione
I macrofagi sono le cellule immunitarie più versatili e possiedono una significativa plasticità ed eterogeneità. I macrofagi possono polarizzarsi in due estremi principali ed esprimere fenotipi corrispondenti (M1 e M2). Poiché la polarizzazione è la premessa per i macrofagi di esercitare le loro diverse funzioni biologiche, i diversi macrofagi polarizzati svolgono ruoli diversi nel processo fisiologico di guarigione anastomotica e nella patogenesi della AL. Rivedere la SLA dal punto di vista dei macrofagi contribuisce all’esplorazione di nuovi strumenti diagnostici e obiettivi terapeutici. Per esempio, in diverse fasi di recupero dopo la costruzione dell’anastomosi, lo spettro di citochine e mediatori infiammatori come IL-1β, IL-6, IL-10, IL-12, TNF-α, ROS e NO, che sono secreti dai macrofagi, può apparire un’alterazione. Inoltre, il livello di queste sostanze potrebbe riflettere indirettamente la situazione di un’anastomosi. Una fluttuazione anormale di queste sostanze indica probabilmente il disordine e la defezione della guarigione dell’anastomosi, che può essere considerata una premonizione di AL. Poiché i macrofagi di tipo M1 mostrano un effetto stimolante sulla AL e i macrofagi M2 sono essenziali per la guarigione delle anastomosi, la regolazione della polarizzazione M1/M2 potrebbe trovare il suo ruolo terapeutico nel trattamento della AL in futuro.
Conflitti di interesse
Gli autori dichiarano che non c’è alcun conflitto di interesse riguardo alla pubblicazione di questo articolo.
Contributi degli autori
Jinyao Shi e Zhouqiao Wu sono i primi autori.
Riconoscimenti
Questo articolo è sostenuto dalla Beijing Municipal Science and Technology Commission (n. D141100000414004 e Z151100004015070) e Beijing Municipal Commission of Health and Family Planning (n. 2014-1-2151).