Abstract
Nel 1992 abbiamo riportato un nuovo metodo di sequenziamento delle proteine dal carbossi-terminale (C-termine) (Boyd et al., 1992). Negli ultimi 2 anni, abbiamo continuato le nostre indagini, compreso il meccanismo dell’attivazione iniziale del gruppo carbossilico C-terminale e le modifiche deliberate delle catene laterali reattive degli amminoacidi con i reagenti di sequenziamento. Attraverso la selezione dei reagenti e delle condizioni di reazione utilizzati per il nostro protocollo di sequenziamento, l’acido aspartico, l’acido glutammico, la serina e la treonina sono derivatizzati. L’amidazione dell’acido aspartico e glutammico, e l’acetilazione della serina e della treonina, hanno portato a rendimenti migliori nel sequenziamento di questi residui. L’acido aspartico e glutammico sono ora classificati, come si vede nella tabella 1, come residui di aminoacidi che sono facilmente sequenziabili. Il nostro criterio per determinare se un residuo è chiamato in modo affidabile è la capacità di sequenziare e rilevare quel residuo quando è presente in una nanomole di un campione proteico. In media, è possibile sequenziare 5 cicli su una nanomole di proteina applicata alla membrana di difluoruro di polivinilidene (PVDF) se la sequenza di aminoacidi contiene quei residui elencati nella colonna “chiamati in modo affidabile” della tabella 1. Il nostro obiettivo per la conferenza MPSA del 1994 è di illustrare l’attuale utilità di questo metodo di sequenziamento C-terminale nel sequenziamento di proteine immobilizzate su PVDF.