Sintesi asimmetrica della batrachotossina: Le tossine enantiomeriche mostrano una divergenza funzionale contro il NaV

Gli effetti fenotipici dei veleni acuti trovati nella ricca farmacopea della vita terrestre e marina sono stati documentati dall’antichità. L’isolamento e la caratterizzazione dei composti tossici hanno reso disponibili importanti reagenti chimici per lo studio di complessi circuiti biochimici (1). Studi di questo tipo hanno rivelato un gran numero di agenti peptidici e di piccole molecole che hanno come bersaglio i canali ionici del sodio (NaV), una classe obbligatoria di proteine di membrana per la segnalazione bioelettrica (1-4). Tra la collezione di noti modulatori NaV sono tre agenti strutturalmente correlati, (-)-batrachotoxin , veratridine, e aconitine (Fig. 1A) -stericamente grandi, derivati amminici lipofili creduto di condividere un luogo comune di legame nella regione poro interno di NaV (3) (sito 2, Fig. 1B). L’influenza di queste tossine sul gating degli ioni, tuttavia, differisce nettamente. Ad un estremo, (-)-BTX, il principale costituente tossico delle rane velenose colombiane (genere Phyllobates), è un agonista completo di NaV, inducendo il canale ad aprirsi più facilmente a potenziali di membrana iperpolarizzati e bloccando l’inattivazione veloce (tra gli altri effetti caratteristici) (3-5). Al contrario, le attività di veratridina e aconitina sono meglio descritte come agonismo parziale e inibizione della funzione del canale, rispettivamente (5). Nonostante le recenti intuizioni della biologia strutturale sull’architettura tridimensionale dei NaV procariotici (6-9), manca una comprensione molecolare dell’influenza delle tossine del sito 2 sulla conduzione ionica e sulla cinetica di gating degli ioni. Gli studi di struttura-attività delle tossine, in combinazione con esperimenti di mutagenesi della proteina, possono affrontare le questioni relative alla natura dinamica della funzione del canale e possono guidare la progettazione razionale di modulatori di piccole molecole dell’attività di NaV (1). La potenza di (-)-BTX (10), la sua storia storica come archetipo di piccola molecola sito 2 sonda (4), e i suoi effetti ineguagliabili sul canale gating renderlo un ottimale “piombo” composto per tali indagini.

(-)-BTX legame a NaVs altera ogni aspetto della funzione del canale, con conseguente spostamento iperpolarizzato nella dipendenza dalla tensione di attivazione, inibizione di inattivazione sia veloce e lento, una diminuzione della conduttanza singolo canale, e la riduzione della selettività ionica (3, 4). L’utilità di questo prodotto naturale come attivatore di NaV ha portato a un sostanziale esaurimento dell’offerta mondiale, che una volta superava 1 g ma era inferiore a 170 mg nel 2009 (11, 12). Da quando la tossina è stata isolata per la prima volta nel 1963 da Märki e Witkop da rane velenose raccolte nella foresta pluviale settentrionale della Colombia (13), Phyllobates è stato inserito nella lista delle specie in pericolo, e quindi la raccolta di (-)-BTX naturale da questa fonte è limitata. (-)-BTX è stato identificato anche in specie selezionate di uccelli (genere Pitohui e Ifrita) (14) e coleotteri (genere Choresine) (15), ma solo in piccole quantità (ad esempio, ~ 1,8 μg di (-)-BTX per coleottero). Anche se semi (16) e sintesi racemiche (17) di BTX-A (Fig. 1C), un composto privo dell’estere pirrolo C-20, sono stati divulgati, la lunghezza di ciascuno di questi lavori (>45 passi lineari) preclude la produzione facile di (-)-BTX o analoghi selezionati. Di conseguenza, il nostro desiderio di utilizzare BTX e forme modificate dello stesso per esaminare la dinamica del canale e meccanismi di gating degli ioni ha motivato i nostri sforzi per ottenere il prodotto naturale attraverso la sintesi de novo.

L’analisi retrosintetica di (-)-BTX ci ha portato a delineare un piano che consentirebbe l’assemblaggio in fase avanzata dell’anello E omorfolina ed elaborazione dell’estere allilico C-20 (Fig. 1C), facilitando così l’accesso a forme modificate della tossina. Precedenti studi di relazione struttura-attività utilizzando un piccolo numero di derivati semisintetici BTX (10, 18) e analoghi C/D/E-ring BTX (19) hanno rivelato l’importanza del C-20 estere, ammina terziaria, e scheletro tetraciclico per l’attività agonista NaV. Svelare BTX-A espone una struttura steroidea 1, il cui assemblaggio è confuso da due gruppi angolari alla giunzione C/D-ring, il C-11 eso-metilene e il C-8/C-9 alchene. Per massimizzare la convergenza nel nostro piano sintetico, abbiamo concepito una strategia di disconnessione per 1 attraverso l’anello C. Questa idea ridurrebbe il problema di costruire 1 in due frammenti, uno che esprime il sistema A/B-ring (3, 20) e un secondo che comprende il ciclopentano D-ring (4, 21). L’esecuzione di successo di questo schema potrebbe produrre la tossina desiderata attraverso una sequenza di passi lineari per un totale di non più di 20 a 25.

La nostra sintesi di (-)-BTX è iniziata con l’accoppiamento di methylenecyclopentanone 4 (21) (fig. S1A) e vinile bromuro 3, accessibile da (S)-(+)-Hajos-Parrish chetone attraverso una sequenza modificata di passi originariamente delineata da Parsons e collaboratori (20) (fig. S1B). Congiunzione di frammenti 3 e 4 per generare il collegato A/B/D-triciclo 5 presentato il primo di una serie di sfide di sviluppo del processo. Un primo tentativo di effettuare questa trasformazione coinvolto Li-Br scambio di 3 con n-BuLi (Bu, butile) e aggiunta sequenziale di enone 4. Anche se 5 è stato consegnato in queste condizioni, i rendimenti dei prodotti non hanno mai superato il 30%. Esperimenti di deuterio quenching con D2O convalidato la nostra ipotesi che α-deprotonazione di 4 era competitivo con il percorso desiderato chetone aggiunta. Transmetalation reazioni delle specie vinil-litio con ZnCl2, ZnBr2, MgBr2-OEt2 (Et, etile), CeCl3, Yb (OTf)3 (Tf, trifluoromethansulfonate), CeCl3-2LiCl, e LaCl3-2LiCl sono stati esaminati, ma nessuna di queste misure si è rivelata efficace (22, 23). L’aggiunta di un equivalente di LiBr anidro al mezzo di reazione di 3 ha migliorato l’efficienza di accoppiamento del >20% (24). Seguendo questa pista, un protocollo ottimizzato utilizzando 2,1 equivalenti di t-BuLi, che presumibilmente genera un equivalente di LiBr in situ, riproducibilmente permesso 5 come un singolo diastereomero nel 65% resa su una scala multigrammo. La facilità di sintesi di questo materiale e la sua forma desilililato 6 abilitato successivi sforzi per identificare le condizioni per l’annulazione tandem dell’anello C e l’installazione del centro quaternario C-13.

Una valutazione dei metodi disponibili per la chiusura dell’anello di 1,6-enynes ci ha portato a considerare radicale-iniziato processi (25). In tali condizioni, un incipiente radicale C-13 3° potrebbe essere intercettato per forgiare l’unità amminometilenica angolare (o un adeguato surrogato). Gli sforzi per esaminare prima la formazione dell’anello C su 6, tuttavia, hanno rivelato la potenziale fallacia di questo piano. Usando n-Bu3SnH e trietilborano (Et3B) per promuovere l’evento di ciclizzazione ha portato alla generazione di due isomeri, 7 e 8, in un rapporto 1:5 che favorisce il prodotto indesiderato (Fig. 2A). Gli studi di Stork e Beckwith e collaboratori hanno dimostrato che la concentrazione del substrato e la temperatura di reazione possono influenzare la modalità di ciclizzazione (cioè, 5-exo-trig contro 6-endo-trig) nelle reazioni enyne mediate da radicali (26, 27). A temperatura elevata (130 ° C) e con cinque volte la diluizione di 6, un’inversione di selettività è stato osservato, ottenendo un leggero eccesso del tetraciclo desiderato (1,3: 1 rapporto di 7 a 8; Fig. 2A). La resa del prodotto combinato di questa trasformazione ha superato il 90%, incoraggiando così ulteriori esplorazioni di questa chimica, nonostante i risultati modesti selettività.

Ripetuti tentativi di catturare il radicale intermedio C-13 con ossima e derivati idrazone generato da formaldeide non è riuscito a fornire il prodotto atteso amminometilazione (28). Costretti a considerare soluzioni alternative, abbiamo riconosciuto che un gruppo sililico etere modificato aggiunto dal vicino alcool C-14 sarebbe stato posizionato adeguatamente per intercettare il 3° radicale (29). Sulla base dei precedenti disponibili, un cloruro alchinasilico, Me3SiC≡CSiEt2Cl (Me, metile), è stato selezionato per la modifica dell’alcol C-14 in 6 (30, Fig. 2A). Il trattamento del risultante sililetere (9) con n-Bu3SnH ed Et3B a 150°C ha portato ad una cascata di ciclizzazione per dare il pentaciclo 10 come prodotto esclusivo (31). Entro i limiti della risonanza magnetica nucleare protonica (1H NMR), nessuno dei corrispondenti isomeri dell’anello C a cinque membri è stato generato in questo processo. I nostri sforzi preliminari per capire il ruolo dei gruppi sostituenti C-14 sulla selettività di reazione suggeriscono che la protezione sililica dell’alcool (insieme con le elevate temperature di reazione) favorisce 6-endo-trig chiusura dell’anello. Anche se ulteriori studi sono garantiti per apprezzare questi dati di struttura-selettività, la nostra cascata enyne ciclizzazione offre un approccio convergente per sintetizzare sostituiti ponteggi steroidei e dovrebbe facilitare l’accesso a una vasta gamma di tali composti.

Inspezione ravvicinata dei prodotti radicali di ciclizzazione derivati da o 6 o 9 ha rivelato un risultato inaspettato per quanto riguarda la struttura della moiety organostannane risultante (Fig. 2, A e B). Carbostannylation del gruppo alchinico dovrebbe permettersi un prodotto vinile-stagno, come notato nella reazione di 6. Inaspettatamente, quando 9 è stato sottoposto alle condizioni di reazione, allylstannane 10 era l’unico prodotto, un risultato confermato da entrambi NMR e cristallografia a raggi x. Formazione di allilstannano 10 può essere razionalizzato attraverso un meccanismo che coinvolge 1,4-H-atomo trasferimento di un radicale vinile intermedio (32) (Fig. 2B), una proposta supportata da un esperimento di etichettatura deuterio (fig. S5). Anche se questo risultato non era previsto, l’efficienza e la selettività della reazione di ciclizzazione ha costretto la nostra decisione di avanzare questo materiale. Guardando avanti, la versatilità del gruppo allylstannane dovrebbe servire futuri sforzi per preparare C anello-modificato BTXs.

La disponibilità di 10 in nove passi dal Hajos-Parrish chetone permesso la produzione di notevoli quantità di materiale per completare la sintesi obiettivo. L’escissione dell’etere sililico ponte in 10 è stato realizzato con eccesso n-Bu4NF, rivelando un intermedio diolo che è stato successivamente avanzato a 11 attraverso 2-iodoxybenzoic acido mediata ossidazione alcol e scissione vinilsilano chemoselettiva (57%; Fig. 2B). La conversione dell’aldeide 11 in cloroacetammide 12 è stata eseguita seguendo una sequenza in tre fasi, in una sola botte (16, 33). Da 12, la chiusura efficiente dell’anello omorfolinamide con NaOEt (92%) (17) ha fornito un intermedio versatile per la modifica di entrambe le unità C e D-ring. Quest’ultimo potrebbe essere ottenuto attraverso l’enolo triflato dell’anello D, preparato usando KN(SiMe3)2 e PhNTf2.

L’induzione dell’alcool C-11α dall’anello C dell’allilstannano 13 ha presentato una delle sfide più difficili nel nostro approccio al BTX (Fig. 2B). Anche se protodestannylation di 13 per generare il corrispondente C-11 eso-metilenecicloesano ha avuto un successo limitato (34), tutti i successivi tentativi di ossidare questo composto al chetone 15 (cioè, O3, OsO4, e RuO4) non è riuscito a dare prodotto. Ispirato da un rapporto di Kim e Fuchs, abbiamo tentato di convertire 13 al corrispondente cloruro di allile utilizzando CuCl2 (35). Fortuitamente, conducendo questa reazione in diossano in condizioni aerobiche consegnato enal 14 in 85% resa con solo una piccola quantità di prodotto clorurato (~ 10%). Anche se i dettagli meccanicistici di questa trasformazione rimangono poco chiari, siamo a conoscenza di un solo altro esempio documentato di tale reazione di ossidazione, che utilizza un catalizzatore di vanadio e O2 (36). Enal 14 è opportunamente disposto per la conversione a C-11 chetone 15 seguendo una serie di passaggi di interconversione del gruppo funzionale evidenziato da un riarrangiamento di Curtius (37). L’assenza di un cromoforo vitale sulla batrachotossina A (BTX-A) rende difficile la purificazione di questo materiale; di conseguenza, nella sequenza che porta a 15, l’acetale metossi C-3 è stato scambiato con alcol p-metossifenetico.

Il completamento dello scheletro di carbonio di (-)-BTX è stato realizzato attraverso un cross-coupling catalizzato da palladio di tributyl(1-ethoxyvinyl)tin a vinyl triflate 15 (Fig. 3A) (38). In situ idrolisi dell’etere enolico incipiente con 1 M acido ossalico fornito enone 16 (77%). A seguito di un ampio schermo di agenti riducenti, la riduzione globale stereoselettiva di successo dell’enone 16 è stata realizzata nel rendimento del 33% dal trattamento con AlH3 appena preparato (39). Ipotizziamo che il lattame Lewis-basico (o una forma ridotta) agisca come un elemento stereocontrollore fondamentale, poiché il trattamento dell’enone 15 con agenti riducenti alternativi idruro consegnato l’alcool C-11β indesiderato esclusivamente. L’uso di AlH3 ha anche favorito la generazione del corretto epimero dell’alcool allilico C-20, un risultato sterochimico che può essere razionalizzato attraverso un modello che invoca il controllo della chelazione (38). Deprotezione del prodotto dalla riduzione AlH3 in condizioni acide permesso (-)-BTX-A in resa 83% (17). Infine, impiegando una modifica di Tokuyama, Daly, e Witkop (-)-BTX-A protocollo acilazione con l’anidride mista preparato da cloroformiato di etile e 2,4-dimetil-pirrolo-3-carbossilico acido (10), la sintesi di 2 mg di (-)-BTX è stato completato (79%, 0,25% resa complessiva) in 24 passi da (S)-(+)-Hajos-Parish chetone. Il prodotto era identico in tutti gli aspetti con un campione del materiale naturale e con i dati spettroscopici precedentemente registrati (40, 41). Il nostro piano sintetico ha anche permesso la preparazione su scala millimetrica dell’antipodo innaturale della tossina, (+)-BTX, il noto estere benzoato di (-)-BTX-A (BTX-B; Fig. 3B) (42, 43), e l’enantiomero di questo composto (ent-BTX-B).

La caratterizzazione elettrofisiologica del sintetico (-)-BTX e BTX-B contro il NaV1.4 del ratto (rNaV1.4) ha confermato che quest’ultimo funziona anche come agonista ed è simile in potenza al prodotto naturale (fig. S6 e tabella S12). Rapporti precedenti e i nostri studi indicano che il gruppo estere di BTX-B è più stabile dell’acilpirrolo sensibile all’ossidazione di BTX; quindi, ulteriori esperimenti sono stati eseguiti con il primo composto (42, 43). BTX-B sintetico è stato testato contro un sottoinsieme di isoforme NaV rappresentative, tra cui rNaV1.4, NaV1.5 umano e NaV1.7 umano. Applicazione di 10 μM BTX-B alle cellule dell’ovaio di criceto cinese che esprimono un singolo sottotipo NaV ha portato a sostenere la corrente di sodio in tutti i casi (Fig. 4A e figg. S7 e S8). Uso-dipendente agonismo di isoforme NaV da BTX-B impedito inattivazione steady-state di >80% della popolazione del canale del sodio (Fig. 4A e fig. S8). BTX-B ha anche indotto un caratteristico spostamento iperpolarizzante (-44.9 a -51.5 mV) nella tensione semimassimale (V0.5) di attivazione delle isoforme NaV wild-type (Fig. 4B e tabella S13). La somiglianza di questi dati è coerente con l’alta conservazione della sequenza proteica tra i sottotipi NaV nel poro interno di rivestimento S6 eliche che formano la tossina putativo sito di legame (fig. S9).

Seguendo il lavoro precedente dal nostro laboratorio (19) e altri (44, 45), ci siamo chiesti se la forma enantiomero di BTX sarebbe legare con alta affinità a NaV con effetti funzionali analoghi. Tale domanda può essere risposto solo con la disponibilità di una sintesi de novo della tossina. Di conseguenza, registrazioni elettrofisiologiche con ent-BTX-B sono state eseguite contro rNaV1.4. Questi dati hanno rivelato che ent-BTX-B è un antagonista del canale dipendente dall’uso e dallo stato, con una concentrazione inibitoria semimassimale misurata di 5,3 ± 0,6 μM. La concentrazione per l’inibizione semimassimale di NaV da ent-BTX-B è simile in grandezza alla concentrazione efficace semimassimale per agonismo BTX-B (1,0 ± 0,1 μM; fig. S10) misurata in condizioni identiche. In particolare, a differenza dell’antipodo naturale, il legame ent-BTX-B ha causato solo uno spostamento minimo nella V0.5 di attivazione e la V0.5 di inattivazione allo stato stazionario (tabella S14). Inoltre, il blocco del canale era completamente reversibile da questo inibitore.

Per determinare se BTX-B e ent-BTX-B condividono un sito di legame sovrapposto all’interno della regione del poro interno di NaV, ent-BTX-B è stato testato contro cinque mutanti a punto singolo rNaV1.4 che hanno dimostrato precedentemente di destabilizzare il legame BTX (Fig. 4, E e F, e fig. S12) (19). Mutazione di N434 (46), L1280 (47), F1579 (48), e N1584 (48) alla lisina ha portato ad un ~ 3- a 30 volte diminuzione del blocco corrente da 5 μM ent-BTX-B. Contro F1236K (49), tuttavia, ent-BTX-B mantenuto attività significativa (33.6 ± 2.1% inibizione corrente). La differenza evidente tra ent-BTX-B e BTX-B indica una regione di legame sovrapposta, ma non identica, all’interno della cavità interna del poro. Sembrerebbe che il canale aperto sia sufficientemente grande per ospitare ligandi lipofili di ammine terziarie (19, 45, 50). Sottili alterazioni nella posizione di legame di questi ligandi sembrano alterare drammaticamente la risposta funzionale della proteina. Le indagini future saranno dirette a delineare le precise interazioni canale-tossina che distinguono l’attivazione dall’inibizione da parte dei derivati del BTX e delle tossine lipofile correlate.