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I virus influenzali umani solitamente infettano il sistema respiratorio superiore, causando starnuti, naso che cola e tosse, così come febbre, malessere e artralgia (22). Inoltre, complicazioni neurologiche sono state riportate anche quando un nuovo sottotipo di virus influenzale viene introdotto nella popolazione umana, come esemplificato dalle pandemie spagnola (1918) e asiatica (1957) (2-4, 6, 10, 18, 22).
Nel 1997, il virus influenzale H5N1, che ha avuto origine nel pollame, ha causato un’epidemia nell’uomo. Da allora, più di 500 persone sono state infettate dal virus H5N1 in tutto il mondo, con un tasso di mortalità di circa il 60% (21). L’infezione umana da virus H5N1 si manifesta generalmente come una grave polmonite, che progredisce fino alla sindrome da distress respiratorio acuto; tuttavia, alcune vittime del virus H5N1 hanno avuto un coinvolgimento neurologico (1). L’RNA virale H5N1 e gli antigeni sono stati rilevati nel cervello dei pazienti e il virus stesso è stato isolato dal liquido cerebrospinale (5, 7). Questi dati suggeriscono che alcuni virus H5N1 potrebbero causare encefalite nell’uomo, come è avvenuto nelle prime fasi della pandemia spagnola e asiatica.
I furetti rappresentano un utile modello mammifero di infezione influenzale perché sono altamente suscettibili all’infezione con virus influenzali e sviluppano alcuni dei sintomi dell’influenza che si vedono negli esseri umani (8, 12, 14, 16, 19). La neuroinvasività di un virus influenzale H5N1 dopo esposizione intranasale è stata riportata anche in un modello di furetto (23). Pertanto, per studiare gli effetti neurologici a lungo termine dell’infezione da virus H5N1, abbiamo infettato furetti con virus H5N1 che causano sintomi lievi in questi animali e abbiamo osservato gli effetti sul sistema nervoso centrale (SNC) per 9 mesi. Abbiamo anche cercato di chiarire la via attraverso la quale questi virus H5N1 hanno invaso il SNC.
Furetti di sei mesi sono stati inoculati intranasalmente con 106 PFU di virus A/Hong Kong/483/1997 (H5N1; HK483) o A/Hong Kong/486/1997 (H5N1; HK486). Questi virus sono stati propagati in cellule di rene canino Madin-Darby (MDCK) in un terreno essenziale minimo integrato con lo 0,3% di sieroalbumina bovina. Nei giorni 3, 6 e 12 e nei mesi 1, 3, 6 e 9 post-infezione (p.i.), abbiamo prelevato campioni di tessuto per l’isolamento del virus e l’esame patologico. I furetti erano letargici e mostravano segni e sintomi di infezione respiratoria durante i primi 10 giorni p.i. ma mancavano segni neurologici apprezzabili, che è in contrasto con i risultati riportati in precedenza (23). Campioni di tessuto da turbinati nasali, polmoni, trachea, cervello, fegato, milza, reni, cuore, pancreas e midollo spinale sono stati raccolti e omogeneizzati in una sospensione al 10% con soluzione salina a base di fosfato. Il titolo del virus in ogni tessuto è stato determinato utilizzando saggi a placche. I virus si sono replicati principalmente nei turbinati nasali, con titoli virali che raggiungevano 105 a 106 PFU/grammo di tessuto da 3 a 6 giorni p.i. (Tabella 1). I tessuti cerebrali raccolti da furetti infettati con HK483 o HK486 sono stati conservati in formalina neutra tamponata al 10% e trattati per l’inclusione in paraffina. I tessuti inclusi in paraffina sono stati tagliati in fette di 5 mm di spessore e colorati con ematossilina ed eosina (H&E). Ulteriori sezioni sono state tagliate per la colorazione immunoistologica con anticorpi policlonali di coniglio contro un virus influenzale H5. L’esame istologico ha rivelato l’invasione neuronale o danni, compresa l’infiammazione del plesso coroideo (Tabella 2). Furetti infettati con il virus HK486 mostrato prove di infiammazione nonsuppurative (Fig. 1a) e l’espressione dell’antigene virale (Fig. 1b) che persisteva per 12 giorni; antigeni virali non sono stati rilevati a 1 mese p.i. L’encefalite nonsuppurative durato per 3 mesi (Fig. 1c), con cicatrici residue gliali apparente a 6 e 9 mesi p.i. nelle zone in cui sono stati rilevati antigeni virali nella fase precedente (Fig. 1d). Inoltre, furetti infettati con HK486 mostrato lesioni macroscopiche del sistema olfattivo al giorno 12 p.i. (Fig. 1e e f). Questi risultati suggeriscono che mentre i virus H5N1 altamente patogeni colpiscono principalmente le vie respiratorie dell’ospite (1), essi possono anche produrre complicazioni neurologiche. In contrasto con il virus HK486, che ha invaso il parenchima cerebrale dei furetti e prodotto gravi danni parenchimali, il secondo ceppo H5N1, HK483, ha causato una grave vasculite non suppurativa senza apparenti danni parenchimali al cervello dei furetti a 6 giorni p.i. Anche se l’antigene virale non poteva essere rilevato all’interno della vascolarizzazione, il danno vascolare era evidente, come caratterizzato da gonfiore endoteliale (Fig. 2a, punte di freccia), cellule apoptotiche sparse (Fig. 2b, punte di freccia), e infiltrazione intramurale di macrofagi (Fig. 2a, frecce) e leucociti polimorfonucleati (Fig. 2b, freccia). Lesioni vascolari sono state trovate al talamo, alla giunzione tra la materia grigia e bianca, e al tronco cerebrale. I campioni di cervello esaminati a 1 e 6 mesi p.i. hanno mostrato lesioni emorragiche indicative di emorragia perivascolare cronica e ripetuta (Fig. 2c) nel talamo, nel cervelletto e nello spazio subaracnoideo del cervello anteriore (Fig. 2d). Queste osservazioni sono coerenti con i rapporti di complicazioni cerebrali emorragiche indotte dal virus dell’influenza durante le epidemie annuali (11). La vasculite cerebrale secondaria all’infezione virale è relativamente comune (17) ed è probabilmente la causa della fragilità della parete vascolare, che porta all’emorragia cerebrale. Sembra ragionevole, quindi, concludere che l’infezione da virus H5N1 nell’uomo può causare un’emorragia cerebrale simile a quella osservata in caso di infezione con altri virus neurotropici.
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Recupero del virus da tessuti di furetti infettati con il virus HK483 o HK486 H5N1
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Prevalenza delle lesioni cerebrali nei furetti in vari punti temporali dopo l’infezione con virus influenzale H5N1 altamente patogeno
Le lesioni cerebrali nei furetti infettati dal virus HK486. (a) Grave encefalite non suppurativa nell’area olfattiva al giorno 6 post-infezione (p.i.). (B) espressione dell’antigene virale in una lesione cerebrale al giorno 12 p.i. Le cellule neuronali e gliali sono colorate con antisiero anti-H5 virus. (Inserto) neuroni non infetti e glia. (c) Encefalite smoldering nel tessuto cerebrale a 3 mesi p.i. (d) Perivascular formazione di cicatrici gliali a 9 mesi p.i. (e) Macroscopicamente visibile lesione del cervello in parte del sistema olfattivo (lobo piriforme) il giorno 12 p.i. (f) Perdita parziale di un bulbo olfattivo (lato superiore del cervello) dovuta a encefalite virale a 1 mese p.i. Confrontare queste immagini con il cervello di un controllo di pari età (cervello inferiore).
Lesioni cerebrali in furetti infettati dal virus HK483. (a) Prominente vasculite non suppurative al giorno 6 p.i. Si noti il rigonfiamento grave di una cellula endoteliale vascolare (punte di freccia) e la migrazione dei macrofagi nella parete vascolare (frecce), rispetto al normale aspetto del parenchima cerebrale circostante. (b) sparse cellule apoptotiche (punte di freccia) e leucociti polimorfonucleati (freccia) nella parete vascolare il giorno 6 p.i. (c) vecchie e fresche lesioni emorragiche nel talamo di un furetto che è stato sottoposto a necroscopia a 6 mesi p.i. (punte di freccia, macrofagi carichi di emosiderina in una vecchia lesione; frecce, emorragia fresca con globuli rossi). (d) fresca emorragia subaracnoidea in un cervello furetto a 6 mesi p.i. Si noti l’accumulo di globuli rossi tra leptomeningi (linea nera tratteggiata) e madre aracnoidea (linea rossa tratteggiata).
Per esaminare il percorso attraverso il quale i virus H5N1 invadono il cervello dei furetti, abbiamo analizzato la distribuzione delle lesioni cerebrali e l’espressione dell’antigene virale osservati nei furetti infettati con i virus HK483, HK486, A/Hong Kong/213/2003 (HK213), A/Vietnam/1204/2004 (VN1204), e A/duck/Vietnam/NCVD-18/2004 (NCVD18). I virus HK213, VN1204 e NCVD18 sono stati propagati in cellule MDCK in terreno essenziale minimo integrato con lo 0,3% di sieroalbumina bovina. Furetti di sei mesi sono stati inoculati per via intranasale con 106 PFU di virus. I tessuti cerebrali sono stati raccolti nella fase acuta, a 3 e 6 giorni dopo l’infezione per VN1204 e NCVD18, e inoltre a 12 giorni dopo l’infezione per HK213. I tessuti sono stati trattati per la colorazione H&E e l’immunoistochimica per l’esame istologico. Le lesioni parenchimali cerebrali prodotte da VN1204, NCVD18 e HK213 erano caratterizzate da encefalite non suppurativa e il modello di espressione degli antigeni virali era essenzialmente lo stesso di quello di HK486 (dati non mostrati). Per comprendere la distribuzione tridimensionale (3D) delle lesioni cerebrali e antigeni virali, li abbiamo tracciati da 3D imaging (TRI/3D-SRF2; Ratoc System Engineering Co., Ltd., Giappone) di un giallo mangusta (Cynictis penicillata) cervello, la cui architettura ricorda da vicino quella del cervello furetto (20). Per visualizzare la via olfattiva (cioè, la via sensoriale per il senso dell’olfatto), abbiamo segnato le vie nervose dal bulbo olfattivo alla corteccia piriforme sulle immagini 3D come un quadro di riferimento (Fig. 3a, giallo; vedi anche Movie S1 nel materiale supplementare). Abbiamo trovato tre modelli distinti di lesioni cerebrali, con e senza antigeni virali, causati dai diversi virus influenzali H5N1: quelli distribuiti solo lungo la via olfattiva (Fig. 3b e c, linea gialla tratteggiata; vedi anche Film S2 e S3) (HK213 e NCVD18); quelli rilevati lungo la via olfattiva (Fig. 3d ed e, linea gialla tratteggiata; vedi anche Film S4 e S5) e nel tronco cerebrale (Fig. 3d ed e, frecce bianche; vedi anche Film S4 e S5) (HK486 e VN1204); e quelli in altre aree (Fig. 3f; vedi anche Film S6) (HK483). La base per separare il terzo gruppo di lesioni dagli altri due gruppi è più evidente quando le distribuzioni delle lesioni sono esaminate dal posteriore (Fig. 3g e h, giallo contro blu contro rosso). Questi risultati di mappatura indicano che la maggior parte dei ceppi H5N1 che abbiamo testato hanno invaso il cervello attraverso la via olfattiva (Fig. 3, linea gialla tratteggiata). Un’eccezione era il ceppo HK483 (Fig. 3f), che ha chiaramente preso di mira la vascolarizzazione del cervello nei furetti, producendo lesioni al di fuori del sistema olfattivo.
Distribuzione delle lesioni cerebrali dopo l’infezione con i ceppi HK483, HK486, HK213, NCVD18 o VN1204 del virus H5N1. Le lesioni cerebrali sono mappate su immagini tridimensionali di un cervello di mangusta gialla. Sono state analizzate parti selezionate delle sezioni del cervello; pertanto, i grafici delle posizioni delle lesioni sono discontinui. (a) Via olfattiva (giallo). La distribuzione delle lesioni e degli antigeni virali (rosso) associati all’infezione da HK213 (b) o NCVD18 (c) segue la via olfattiva (linea gialla tratteggiata). Negli animali infettati con HK486 (d) o VN1204 (e), le lesioni e gli antigeni virali si trovano nel tronco cerebrale (frecce bianche) e nella via olfattiva (trame rosse all’interno della linea gialla tratteggiata). Il ceppo HK483 (f) ha causato gravi danni ai vasi sanguigni, con evidenti lesioni emorragiche (trame blu). (g) Vista posteriore della via olfattiva (trame gialle). (H) Vista posteriore delle lesioni emorragiche indotte da HK483 (blu) e vasculite (rosso) al di fuori della via olfattiva. I pannelli da a a f sono viste ventrali.
Prima che i virus H5N1 possano diventare pandemici, dovranno probabilmente acquisire la capacità di crescere bene nella porzione superiore delle vie respiratorie umane, il che porterebbe a un’efficiente trasmissione da uomo a uomo tramite starnuti e tosse (13, 22). I nostri dati sui furetti suggeriscono che se i virus H5N1 altamente patogeni guadagnano questo punto d’appoggio nell’uomo, potrebbero causare complicazioni neurologiche subcliniche invadendo il cervello attraverso le vie nervose o causando vasculiti cerebrali. In precedenza, un virus H3N2 è stato rilevato in cervelli di furetto; tuttavia, la quantità di virus nei cervelli era bassa (meno di 102,2 log10 50% di dosi infettive delle uova) e non è stata riportata alcuna prova di antigeni del virus nel cervello (23). Abbiamo scoperto che il virus pandemico H1N1 del 2009 si è replicato in modo più efficiente nelle vie respiratorie dei furetti rispetto a un virus H1N1 stagionale umano (9, 13, 15) e ha causato lesioni non suppurative del bulbo olfattivo; tuttavia, non abbiamo trovato il virus nel parenchima cerebrale di questi animali (dati non mostrati). Pertanto, l’invasione parenchimale del cervello, come dimostrato dalla presenza di antigeni virali, è una caratteristica dei virus H5N1. Sarebbe, quindi, pertinente eseguire studi retrospettivi e prospettici per complicazioni neurologiche subcliniche in pazienti infettati dal virus H5N1. I nostri risultati sollevano la preoccupazione che le complicazioni neurologiche subcliniche potrebbero accompagnare le infezioni respiratorie gravi con la diffusione mondiale dei virus H5N1.