DNA-metyltransferaser (MTaser) som överför en metylgrupp från S-adenosylmethionin till antingen adenin- eller cytosinrester finns i ett stort antal prokaryoter och eukaryoter. Metylering bör beaktas när man smälter DNA med restriktionsendonukleaser eftersom klyvningen kan blockeras eller försämras när en viss bas i igenkänningsstället är metylerad.
Prokaryotisk metylering
I prokaryoter har MTaser oftast identifierats som delar av restriktions-/modifieringssystem som verkar för att skydda värd-DNA från klyvning av motsvarande restriktionsendonukleas. De flesta laboratoriestammar av E. coli innehåller tre platsspecifika DNA-metylaser.
- Dam-metylas-metylering i N6-positionen av adeninet i sekvensen GATC (1,2).
- Dcm-metyltransferaser-metylering i C5-positionen av det andra cytosinet i sekvenserna CCAGG och CCTGG (1,3).
- EcoKI-metylas-metylering av adenin i sekvenserna AAC(N6)GTGC och GCAC(N6)GTT.
Vissa eller alla platser för ett restriktionsendonukleas kan vara resistenta mot klyvning när de isoleras från stammar som uttrycker Dam- eller Dcm-metylaser om metylasets igenkänningsställe överlappar endonukleasets igenkänningsställe. Plasmid-DNA som isolerats från Dam+ E. coli är till exempel helt resistent mot klyvning av MboI, som klyver vid GATC-platser.
Inte allt DNA som isolerats från E. coli är metylerat i samma utsträckning. Medan pBR322-DNA är helt modifierat (och därför helt resistent mot MboI-spjälkning), är endast cirka 50 % av λ DNA Dam-platserna metylerade, förmodligen på grund av att metylaset inte har möjlighet att metylera DNA:t helt och hållet innan det paketeras i faghuvudet. Som ett resultat av detta kommer enzymer som blockeras av Dam- eller Dcm-modifiering att ge partiella digestionsmönster med λ-DNA.
Begränsningsställen som blockeras av Dam- eller Dcm-metylering kan avmetyleras genom att klona ditt DNA till en dam-, dcm- stam av E. coli, t.ex. dam-/dcm- Competent E. coli (NEB #C2925).
Begränsningsställen kan också blockeras om det finns en överlappande plats. I detta fall genereras en del av Dam- eller Dcm-sekvensen av restriktionsenzymsekvensen, följt av den flankerande sekvensen. Denna situation bör också beaktas vid utformning av restriktionsenzymdigests.
Eukaryotisk metylering
CpG MTaser, som finns i högre eukaryoter (t.ex. Dnmt1), överför en metylgrupp till C5-positionen av cytosinrester. Mönster av CpG-metylering är ärftliga, vävnadsspecifika och korrelerar med genuttryck. Följaktligen har CpG-metylering postulerats spela en roll för differentiering och genuttryck (4).
Anmärkning: Effekterna av CpG-metylering är främst ett problem när man smälter eukaryotiskt genomiskt DNA. CpG-metyleringsmönster bibehålls inte när DNA:t klonas in i en bakteriell värd.
Metyleringskänslighet
Tabellen nedan sammanfattar metyleringskänsligheten för NEB:s restriktionsenzymer och anger om klyvningen blockeras eller försämras av Dam-, Dcm- eller CpG-metylering om eller när den överlappar varje igenkänningsplats. Denna tabell bör ses som en vägledning för beteendet hos de angivna enzymerna snarare än som en absolut indikator. Se REBASE , restriktionsenzymdatabasen, för mer detaljerad information och specifika exempel som dessa riktlinjer bygger på.
- Marinus, M.G. och Morris, N.R. (1973) J. Bacteriol. 114, 1143-1150. PMID: 4576399
- Geier, G.E.and Modrich, P. (1979) J. Biol. Chem. 254, 1408-1413. PMID: 368070
- May, M.S. and Hattman, S.(1975) J. Bacteriol. 123, 768-770. PMID: 1097428
- Siegfried, Z. and Cedar, H. (1997) Curr. Biol. 7, r305-307. PMID: 9115385
Legend
| ● | Inte känslig | ◆ | Svårt. |
| ◼ | Blockerad | ◇ ol | Bedöms av överlappning |
| ◻ ol | Blockerad av överlappande | ◇ scol | Blockerad av vissa kombinationer av överlappande |
| ◻ scol | Blockerad av vissa kombinationer av överlappande | ||
Kod med en bokstav