Konvexa Arrhenius-plottar och deras tolkning

Under de senaste åren har ett ökande antal studier mätt temperaturberoendet av enzymreaktioner för både termostabila och mesostabila enzymer (enzymer från organismer som växer optimalt vid hög temperatur respektive vid normal kroppstemperatur). Temperaturberoendet visas vanligen i en Arrheniusplott, som är den naturliga logaritmen av hastighetskoefficienten i förhållande till reciproken av den absoluta temperaturen (fig. 1). Några av metoderna för att mäta temperaturberoendet av reaktionshastigheter har också tillämpats för att mäta temperaturberoendet av de kinetiska isotopeffekterna (KIE) av de katalyserade reaktionerna, och sådana experiment ger experimentella data som är mycket relevanta för att karakterisera reaktionernas dynamiska flaskhalsar (1-6). Ett stort antal teoretiska modeller har föreslagits för att tolka denna typ av data (7-19).

Experiment på reaktioner som katalyseras av en mängd olika termostabila och mesostabila dehydrogenas- och oxidasenzymer har visat att Arrhenius-plottan för det kemiska steget i vissa fall är konvex (20-23). I denna artikel kommenterar vi betydelsen av denna observation och ger en tolkning av detta fynd som placerar det i det bredare perspektivet av icke-biologisk kemisk såväl som biokemisk kinetik. I denna uppsats påpekas att det konvexa Arrheniusbeteendet innebär en allvarlig begränsning av den mikrokanoniska unimolekylära hastighetskoefficienten för det kemiska steget. I synnerhet kan vi gå bortom den uppenbara tolkningen att en konvex Arrhenius-plott kan tolkas som en lägre än förväntad hastighet vid höga temperaturer, och vi kan under vissa förhållanden säga att den mikrokanoniska unimolekylära hastighetskoefficienten för det kemiska steget faktiskt måste minska med ökande energi.

Inallmäntligen är det önskvärt att separera tolkningen av experimentella data i två steg. Först drar vi allmänna konsekvenser som vilar på solida grunder som termodynamik och allmänna principer för statistisk mekanik. För det andra går vi vidare till mer mikroskopiskt detaljerade modeller som vilar på en mindre säker grund. Den nya aspekten av den nuvarande analysen handlar helt och hållet om det första steget.

Den slående egenskapen hos reaktionerna i refs. 20-23 som vi diskuterar här är den positiva konvexiteten C i deras Arrhenius-plottar, där 1 k(T) är den katalytiska hastighetskoefficienten och T är temperaturen. Vi skriver 2 där 3 Ea är den temperaturberoende fenomenologiska aktiveringsenergin och R är gaskonstanten. En positiv konvexitet innebär alltså att Ea minskar med ökande temperatur. Inom det breda kinetikområdet, utan att begränsa sig till enzymkinetik, är icke-linjära Arrheniusdiagram nästan alltid konkava, dvs. att C är negativt, när de kan observeras. Detta allmänna resultat förklaras av Tolmans tolkning av aktiveringsenergin, som kan skrivas som (25-27) 4 där ett dubbelt överstreck betecknar ett medelvärde över alla reagerande system, och ett enkelt överstreck betecknar ett medelvärde över alla system, oavsett om de reagerar eller inte. Tolmans ekv. 4 anger med andra ord att den negativa delen av den lokala lutningen i ett Arrheniusdiagram kan tolkas som lika med den genomsnittliga energin hos de molekyler som reagerar minus den genomsnittliga energin hos alla möjliga reaktanter. För unimolekylära reaktioner av en termiskt balanserad art: 5 och 6 där E är den totala energin, dP/dE är den normaliserade sannolikhetstätheten för att ett system har energi E i en kanonisk ensemble vid temperatur T, och k(E) är den unimolekylära hastighetskoefficienten för en mikrokanonisk ensemble vid energi E.§ Vanligtvis ökar E̿ snabbare än Ē med ökande T eftersom k(E) vanligen är en ökande funktion av energin.¶ Detta förklarar varför Ea vanligen ökar med T och därmed varför C är negativ. En konvex Arrheniusplott innebär att E̿ minskar eller att den ökar mindre snabbt än Ē när temperaturen ökar, och i nästa stycke hävdar vi att detta vanligen innebär att k(E) minskar med ökande energi över den energiregion som dominerar integralerna i Eq. 6.

Det går att göra ett mer precist uttalande om konsekvensen av att E̿ minskar eller ökar mindre snabbt än Ē när temperaturen ökar. Genom att notera att 7 där β är 1/RT och ρ(E) är tillståndstätheten, och genom att använda ekv. 4-6, kan man lätt visa att 8 Således är påståendet att dEa/dT är negativt detsamma som påståendet att fördelningen av reaktionsenergier är smalare än fördelningen av reaktantenergier. Om dP/dE var symmetrisk kring Ē skulle tecknet på dEa/dT bero på formen på funktionen k(E), och inte bara på dess tecken. Men dP/dE är faktiskt en mycket skev funktion. För typiska molekyler approximeras dess form väl genom att ρ(E) i Eq. 7 sätts lika med En-1, där n är ungefär lika med antalet frihetsgrader (31). Om man antar denna form och också antar att k(E) varierar långsamt och linjärt över det viktiga intervallet för integralerna i Eq. 6, kan man visa att högersidan i Eq. 8 är proportionell mot dk/dE med en positiv proportionalitetskonstant. För mer komplicerade k(E)-funktioner har man inte längre någon exakt proportionalitet, men effektens riktning fastställs av den positiva skevheten hos dP/dE. Även om identiteten mellan tecknen på dEa/dT och dk/dE inte är en matematisk sats, förväntas den gälla för normala tätheter av tillstånd och släta k(E)-funktioner.

Detta resultat innebär en begränsning av alla mikroskopiska tolkningar, och – vilket är lika viktigt – det föreslår nya mikroskopiska tolkningar. Anta till exempel att reaktantkonfigurationsutrymmet kan delas upp i två typer av konformationer, varav den ena (kallad typ R) är reaktiv med hastighetskoefficienten kR(E) och den andra (kallad typ N) är icke-reaktiv med en hastighetskoefficient på noll. Då 9 där PR(E) är den betingade sannolikheten att ett system med energi E befinner sig i en konformation av typ R. Detta ger en mekanism för att k(E) skall minska med E, dvs. PR(E) minskar med E snabbare än kR(E) ökar. Detta kan bero på att system med högre energi besöker en större region av fasrummet och därmed tillbringar en mindre del av sin tid i en enskild begränsad region. Denna tolkning kan vara av särskild betydelse för enzymologi. Under de senaste åren har flera studier syftat till att förstå konformationssamplingens roll i enzymkatalysen (17, 18, 22, 32-37). I en nyligen publicerad översikt hävdade Bruice och Benkovic (17) att de aktiva konfigurationer som provtas av enzymkomplexet inte har högre energi än den allmänna populationen av konformationer och att dessa konformationer kan bestämma reaktionshastigheten. I motsats till de ibland detaljerade modellerna i de citerade artiklarna utgår den nuvarande tolkningen från mycket allmänna grunder utan att åberopa någon särskild mikroskopisk molekylär mekanism eller modell, t.ex. tunneldrivning som främjas av termiskt exciterade enzymfluktuationer (11, 13, 38, 39), beräkningar av aktiveringsenergins fria energi, som inkluderar ett korrekt urval av konformationer (40), eller specifika mekanismer för övergångar mellan mikrotillstånd med varierande konformationell flexibilitet (41-44). Den kan dock klart rymma mer specifika tolkningar, t.ex. ett protein som är stelt vid låg T eller en dynamisk rörelse som kräver population av specifika lågenergivibaserade vibrationstillstånd. Inget vi har sagt här ger dock specifikt stöd till sådana modeller, vars giltighet bör undersökas genom ytterligare experiment och detaljerade simuleringar. I den nuvarande diskussionen åberopas inte specifikt effekter som är förknippade med övergångstillståndsteorins sammanbrott. Kvant effekter som tunnling kan tillgodoses genom att helt enkelt inkludera dem i k(E) eller kR(E).

I samband med vår analys kan de resultat som nämns ovan för det termofila alkoholdehydrogenaset ADH-hT (22, 32) tolkas i termer av de relativa trenderna i E̿ och Ē när temperaturen ändras. En allmänt framtagen hypotes är att termofila enzymer har utvecklats för att fungera i sin fysiologiska nisch, dvs. vid förhöjd temperatur, och att de är mindre aktiva vid rumstemperatur (i vissa fall till och med mindre aktiva än vad som förväntas av deras aktiveringsenthalpi vid fysiologisk temperatur). Vår analys kan erbjuda en koppling mellan denna föreställning och beräkningar som handlar om att identifiera aktiva och icke-aktiva konformationer (16, 17). Wrba et al. (21) rapporterade till exempel en empirisk observation om att för enzymer med olika smälttemperaturer är skillnaden mellan temperaturerna för maximal krökning i Arrheniusdiagrammen likadan som skillnaden i smälttemperatur. Detta kan vara relaterat till förskjutningar i PR(E)- och kR(E)-beroendet av E i de områden som är viktiga vid övergångstemperaturerna för denaturering och aktivitet. Som ett ytterligare exempel noterar vi att det nyligen föreslogs att det ”kanske inte är förvånande att en fördelning av värmeenergi till lågfrekventa proteinslag är en viktig faktor för C-H-bindningsspaltningsreaktioner”. Dessa lägen kan bli kraftigt exciterade vid omgivande temperatur, i motsats till C-H-sträckningsläget, som i stort sett förväntas vara begränsat till sin nollpunktsenerginivå” (22). Denna typ av överväganden kan relateras till temperaturberoendet av E̿ och Ē och därmed till konkaviteten eller konvexiteten hos Arrheniusplottar.

Den allmänna slutsatsen om energiberoendet av den mikrokanoniska hastighetskoefficienten är också tillämplig på konvexa Arrheniusplottar som ibland observeras i andra studier. Om man ska tillämpa dessa argument måste man vara noga med att se till att den konvexa Arrhenius-plotten representerar en sann elementär reaktion med internt jämviktade reaktanter. Till exempel i prototypen av steady-state-problemet 10 där 11 med 12 kan det tillämpas på k1, k-1 eller k2, men inte generellt sett på k. Om k-1 och k1 är mycket större än k2 blir dock k en elementär hastighetskoefficient för A → C, och inga slutsatser förändras av förjämvikten före det hastighetsbestämande steget. Detta gäller vidare för det fall då k2 är mycket större än k1 och k-1, där k blir k1. Ett specialfall där metoden med stationärt tillstånd kan tillämpas är det där A motsvarar obunden reaktant och enzym, tillstånd B är Michaelis-komplexet och tillstånd C är produkten (45). Observera att i detta fall bör k1 (i ekv. 12) vara en andra ordningens hastighetskonstant som leder till Michaelis-ekvationen: 13 där är koncentrationen av reaktanten (substratet), Vmax är reaktionshastigheten vid en mycket högre nivå än KM, som är Michaeliskonstanten, (k2 + k-1)/k1, för ekv. 10. Diskussionen gäller inte effektiva hastighetskoefficienter till följd av en förändring i det hastighetsbestämmande steget eller förändringar i den effektiva enzymkoncentrationen , och inte heller hastighetskoefficienter med hysteres som beror på glasbildning. Denna punkt bör betonas för enzymatiska reaktioner: representerar de uppmätta hastigheterna verkligen en meningsfull konsekvent hastighetskonstant över hela temperaturområdet? I en tidig rapport om en konvex Arrheniusplott för det termofila alkoholdehydrogenaset från Bacillus stearothermophilus (ADH-hT) utfördes till exempel alla mätningar med samma substratkoncentration (som mättade enzymet vid rumstemperatur), och Vmax presenterades (47). I en senare rapport (22) konstaterades att KM ökar med temperaturen, så vid hög temperatur var KM inte tillräckligt stor, och den uppmätta hastigheten visade sig vara långsammare än Vmax, vilket gav en till synes konvex Arrheniusdiagramm. Även för den enklaste realistiska enzymkinetiken bör mekanism 10 utökas med ett steg för produktfrisättning, och data bör analyseras med vederbörlig hänsyn till engagemanget för katalys och katalysförhållandet (48, 49); annars kan den uppmätta kcat visa ett annat temperaturberoende än den inneboende k2. Refs. 20-24 har valts ut som exempel där särskild omsorg har lagts ner för att säkerställa och visa att Arrhenius-ritningen motsvarar ett enda hastighetsbegränsande elementärt kemiskt reaktionssteg som funktion av temperaturen. Rubach och Plapp (personlig kommunikation av opublicerade resultat) använde till exempel tekniker med stoppat flöde före stabilt tillstånd för att mäta KIEs på mikroskopiska hastighetskonstanter för att studera den reaktion som katalyseras av alkoholdehydrogenas i hästlever. De fann konvexa Arrhenius-plottar för både hydrid- och deuteridöverföring, men inget temperaturberoende av KIEs, och de visade att ingen förändring av det hastighetsbestämmande steget sannolikt skulle påverka deras resultat. Vi har dessutom uteslutit fall där temperaturområdet tillåter irreversibelt smält eller delvis smält protein. I kontrast till de enzymatiska exemplen som visar ett konvext Arrheniusbeteende med ett enda elementärt steg, nämner vi fallet med hudpermeation av läkemedel, där ett konvext Arrheniusbeteende har observerats, men där de elementära stegen inte har kunnat sorteras ut eller inte kan sorteras ut (50, 51). Som jämförelse med permeation genom huden nämner vi också att det något bättre definierade fallet med icke-Arrhenius-temperaturberoende av diffusion i amorfa fasta ämnen har modellerats med en site-hopping-modell med flera steg (52, 53).

Ett exempel från organisk kemi ger en användbar illustration av dessa begrepp i samband med en temperaturberoende strukturell omorganisation. Limbach har observerat konvexa Arrheniusplottar (personlig kommunikation av opublicerade resultat) för den baskatalyserade intramolekylära protonöverföringen i 1,3-bis-(4-fluorfenyl)-triazol löst i etylmetyleter . Hastighetskoefficienten representerar ett genomsnitt över olika vätebundna former av reaktanten, särskilt den fria molekylen och komplexet med basen. Protonöverföringen sker i komplexet. Den konvexa Arrhenius-kurvan beror på att molekylen vid hög temperatur övergår till den icke-komplexa formen där barriären för protonöverföring är större (ref. 55 och H. H. Limbach, personlig kommunikation). Tolman-tolkningen är således inte strikt tillämplig eftersom hastighetskoefficienten inte representerar ett enda elementärt steg. Arrhenius-ritningen av reaktionen från båda formerna separat skulle förmodligen vara kvasilinjär eller konkav. Om de olika vätebundna formerna betraktas som konformer av en enda reaktant kan Tolman-tolkningen tillämpas, och den ger en illustration av en molekyl som reagerar långsammare vid högre energi eftersom den utforskar en bredare region av fasrummet som omfattar i huvudsak icke-reaktiva konformer. På samma sätt föreslår Massey et al. (23) en möjlig förklaring till sin konvexa Arrheniusplott som involverar två konkurrerande enzymatiska former som var och en dominerar i ett annat temperaturområde. Denna modell är ett särskilt exempel på en modell som skulle kunna vara förenlig med det modelloberoende resultat som presenteras här. För icke-biologiska reaktioner förväntar vi oss att särskilt reaktiva konfigurationer ofta kommer att vara energirika arter. Det är möjligt att konvexa Arrheniusplottar kommer att vara vanligare i biologiska system eftersom ett enzym kan ha utvecklats specifikt på ett sådant sätt att de lägst energirika tillstånden (dvs. de mest tillgängliga vid omgivande T) är de reaktiva, vilket leder till en låg E̿ även när T ökar.

Konvexa Arrheniusplottar har också observerats för diffusion i underkylda vätskor och glas. Sådana fall, liksom hudpermeationsproblemet som nämns ovan, kan vara komplicerade av flera parallella vägar, men har ändå gett upphov till detaljerad analys. En ofta citerad förklaring är att molekyler i vätskor med låg temperatur diffunderar genom att korsa märkbara potentialbarriärer, medan diffusionsrörelserna vid hög temperatur är nästan fria (24, 56). I denna modell erkänns att när temperaturen höjs kommer de termiska energierna att bli större jämfört med barriärhöjderna; vad som krävs för en konvex Arrheniusplott är att den genomsnittliga energin hos molekyler som gör övergångar (i det här fallet diffusiva hopp från ett lokalt minimum till ett annat) stiger långsammare än den genomsnittliga energin hos alla molekyler. Det finns många detaljerade teorier om icke-Arrheniusbeteende i metastabila vätskor och glas som inte uttryckligen tar upp aktiveringsenergins temperaturberoende i termer av Tolmans tolkning (58), men alla konsekventa förklaringar av en konvex Arrheniusplott i termer av elementära hastighetskoefficienter för lokal jämvikt måste överensstämma med Tolmans resultat på någon underliggande nivå, även om detta inte är explicit eller inte ens erkänt.

Sammanfattningsvis har denna artikel pekat på den grundläggande mikrokanoniska information som ges av en observation av Arrheniusplottans konvexitet, men som uppenbarligen inte tidigare har tolkats. Analysen har en utbredd tillämplighet och ger en bestämd modelloberoende förutsägelse om genomsnittliga energier hos system som gör övergångar. Resultatet är relevant för alla kinetiska områden (enzymer, atmosfärisk kemi, klusterreaktioner etc.) där konvexa Arrheniusplottar kan observeras, och vi har därför hållit presentationen så allmän som möjligt, samtidigt som vi citerar nyligen genomförda experiment med termostabila och mesostabila dehydrogenas- och oxidaskatalysatorer som specifika exempel på fenomenet. Vi har också gjort en koppling till diffusionsteorin. Vi hoppas att det synsätt som förespråkas i denna artikel kommer att stimulera nya sätt att tänka kring reaktionshastigheter, katalys och diffusion.

• Mottagen den 12 september 2000.