Citometria di massa
La citometria di massa, o CyTOF (Fluidigm), è una variazione della citometria a flusso in cui gli anticorpi sono marcati con tag di ioni di metalli pesanti piuttosto che fluorocromi. La lettura avviene tramite spettrometria di massa time-of-flight. Questo permette la combinazione di molte più specificità di anticorpi in un singolo campione, senza spillover significativo tra i canali. Abbiamo pannelli standardizzati per immunofenotipizzazione, fenotipizzazione + colorazione con citochine intracellulari (ICS) e fenotipizzazione + fosfo-CyTOF, ciascuno con 30-38 anticorpi. Contattare [email protected] per i dettagli.
Immunofenotipizzazione: Il nostro pannello di immunofenotipizzazione CyTOF a 33 anticorpi è progettato per l’uso con PBMC crioconservati, sebbene possa essere adattato ad altri tipi di campioni. Un numero limitato di anticorpi aggiuntivi può essere aggiunto ai canali aperti, in base alla disponibilità.
Citochine intracellulari: Il nostro pannello CyTOF ICS a 38 anticorpi è finalizzato principalmente alla dissezione delle risposte delle cellule T. Sono possibili sostituzioni limitate (con quelle comuni elencate).
Fosfo-CyTOF: il nostro pannello di 30 anticorpi fosfo-CyTOF può essere utilizzato con gli stimoli indicati per leggere una vasta gamma di vie di segnalazione in molti sottoinsiemi cellulari diversi. Aggiunte o sostituzioni in questo pannello sono più difficili, a causa del requisito di anticorpi marcatori di superficie per lavorare bene su epitopi fissi.
Vedi l’elenco degli anticorpi standard in questi tre pannelli CyTOF qui. (rivisto giugno 2018)
Per un’intervista video con il Dr. Mike Leipold su questioni sperimentali CyTOF, vedere https://www.youtube.com/watch?v=UYYq9jh7FgQ.
Istruzioni per l’utente
1. Pianificare il tuo test: I test CyTOF sono eseguiti in lotti di massimo 12 campioni. Se hai più campioni, cerca di randomizzare i tuoi lotti in modo che, per esempio, i casi e i controlli non siano segregati in lotti separati.
2. Raccolta dei tuoi campioni: Si prega di utilizzare un PROTOCOLLO DI CRIOPRESERVAZIONE ottimizzato per PBMC vitali. Raccomandiamo di congelare 10^7 cellule per crioconservazione e di fornire una crioconservazione per ciascuno dei saggi sopra indicati. I servizi di trattamento e crioconservazione delle PBMC sono disponibili anche attraverso la nostra Blood Processing Unit.
3. Esecuzione dei tuoi campioni: Un ordine online è richiesto prima che i campioni possano essere analizzati. Il tempo di esecuzione varia a seconda delle dimensioni del vostro progetto e del carico di lavoro corrente; i progetti più piccoli possono essere solitamente completati entro 3-4 settimane dall’ordine e dalla consegna del campione.
4. Analisi dei dati: Forniamo un’analisi standard dei dati utilizzando il software FlowJo. Un rapporto Excel con le percentuali di tutte le popolazioni gated, così come i pdf dei risultati di gating e tutti i file fcs, sono forniti tramite Google Drive. Per i pannelli standard, i dati Excel vengono simulataneamente caricati nel nostro database online, Stanford Data Miner, dove possono essere integrati con altri dati HIMC dal vostro laboratorio, così come i dati clinici/demografici, se forniti. Clicca sul link di aiuto nell’angolo in alto a sinistra della homepage di Data Miner per le istruzioni sull’uso di questo sistema.
La consultazione statistica è disponibile attraverso il servizio di consulenza statistica dell’HIMC.
Protocolli
Si prega di consultare la nostra pagina dei protocolli per i protocolli di laboratorio dettagliati e le brevi descrizioni adatte alle pubblicazioni o alle domande di sovvenzione.
Informazioni aggiuntive:
- Mass Cytometry Review (Trends in Immunology)
- Analisi dei dati CyTOF in FlowJo