Un’inserzione altamente polimorfica nel gene dell’amelogenina del cromosoma Y può essere utilizzata per la biologia evolutiva, genetica delle popolazioni e il sessaggio in Cetacea e Artiodactyla

L’amelogenina può essere utilizzata per il sessaggio molecolare e la genetica evolutiva in Cetartiodactyla

L’amplificazione del segmento studiato del locus amelogenina utilizzando i primer specie-specifici SC1-SC2 ha portato ad un evidente polimorfismo di dimensioni legate al sesso in tutti i Cetacea (Fig. 1) con una banda unica di 521 bp per le femmine (due copie Amel-X) e una banda aggiuntiva di 980 bp per l’Amel-Y nei maschi. Questo modello era evidente nei balenotteri maschi (Mysticetes), ma non c’era alcuna amplificazione Amel-X corrispondente nei delfini maschi a meno che non si usino i primer X5-X6 derivati dalla sequenza di amelogenina umana. Studi precedenti hanno dimostrato che l’amplificazione dell’amelogenina era incline al drop-out allelico o almeno all’amplificazione preferenziale. Questi fenomeni possono essere spiegati da diversi fattori. Di solito, l’amplificazione dell’allele di dimensioni minori è favorita quando la quantità di polimerasi è un fattore limitante o in caso di degradazione del DNA modello. Piccole quantità di DNA possono anche aumentare la stocasticità dell’annealing. Tuttavia, i nostri risultati non sono coerenti con queste situazioni poiché l’allele favorito (Amel-Y) è sempre il più grande. D’altra parte, le differenze nel contenuto di GC e i mismatches nelle sequenze di annealing possono spiegare l’amplificazione differenziale. I frammenti di amelogenina che abbiamo studiato sono caratterizzati da un maggiore contenuto di GC quando vengono amplificati dal cromosoma X (56%) rispetto al cromosoma Y (47%). Questa differenza può derivare da una non-inserzione nel frammento Amel-X. Questa caratteristica, così come un mismatch lungo 2 bp tra l’Amel-X del delfino e l’estremità 5′ del primer inverso SC2 (Fig. 2) può favorire l’amplificazione preferenziale della copia Y nei delfini (Fig. 1b). Infatti, amplificando campioni di delfini maschi SC3 (primer senza mismatch, vedi Fig. 2) invece di SC2, si ripristinano le due bande, viste nei balenotteri. La presenza di questa grande inserzione nella copia Amel-Y può essere usata per la determinazione del sesso probabilmente in tutte le specie di cetacei.

Al fine di definire i punti di rottura della posizione di inserzione Y e indagare la sua storia evolutiva, abbiamo sequenziato vari cetacei (elencati in Metodi; sequenze depositate sotto le seguenti accessioni: EMBL:AM744958 a AM744971). Dopo l’allineamento con le sequenze disponibili di Artiodactyla (vedi elenco in Metodi), abbiamo rilevato lo stesso polimorfismo in tutti gli altri Cetartiodactyla tranne il Maiale (Fig. 3): un’inserzione di 460-465 bp (la dimensione è una funzione degli indel all’interno di diversi individui o specie) situata tra il 4° e il 5° esone (dalla 188° alla 651° posizione delle sequenze Y per esempio EMBL:AM744958). I nomi degli aplotipi e le loro corrispondenti accessioni sono riportati nella tabella 1. La somiglianza delle sequenze è stata controllata eseguendo BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) sulle sequenze della collezione nucleotidica nr/nt di GenBank con l’algoritmo megablast (destinato alle sequenze ad alta somiglianza). Oltre all’Amel-Y bovino e ovino, gli unici due risultati rilevanti (78 e 83% di omologia, valori E 4,10-68 e 3,10-53) corrispondono a un frammento sul settimo cromosoma nei maiali (circa 250 bp), suggerendo che l’inserzione potrebbe essere un elemento trasponibile.

Interpretiamo la presenza di questa inserzione come una sinapomorfia (carattere condiviso) dei Cetartiodactyla escludendo i maiali e probabilmente altri primi gruppi derivati (cammelli, ippopotami; , vedi Fig. 3). Oltre a questa lunga inserzione, 46 altri indel sono stati rilevati dall’allineamento di sequenza (posizioni e dimensioni dettagliate nella Figura 5). Gli indel sono particolarmente utili per testare le ipotesi filogenetiche, in quanto possono fornire informazioni su antiche divergenze piuttosto che informazioni sulla popolazione. Abbiamo quindi valutato se le topologie filogenetiche differivano se prendevamo in considerazione o meno le informazioni contenute in questi indel. Così, le sequenze dei cetacei riassunte nella tabella 1 e le sequenze di Artiodactyla sono state analizzate prima classicamente, con le lacune codificate come caratteri mancanti, e in secondo luogo, con le lacune codificate come caratteri binari supplementari (vedi Fig. 5). Per ogni analisi, sono state eseguite due ricerche bayesiane indipendenti. Gli alberi filogenetici presentati nella Figura 4 sono il risultato di un consenso di 20.000 alberi campionati dopo che la deviazione standard tra le due ricerche è scesa sotto 0,01. Essi mostrano nodi altamente supportati. L’analisi filogenetica eseguita sul segmento completo (Fig. 4a) ha confermato il raggruppamento per copia del cromosoma sessuale in Cetartiodactyla (Stenella cœruleoalba, Balænoptera physalus, Grampus griseus, Tursiops truncatus, Bos taurus e Ovis aries) mentre Amel-X e Amel-Y si sono raggruppati in altri mammiferi (Homo sapiens, Sus scrofa) insieme ad Amel-X di Cetartiodactyla. D’altra parte, la filogenesi dedotta senza tener conto dell’inserzione ha dato un risultato diverso (Fig. 4b): mentre gli aplotipi si raggruppavano anche per cromosoma nei cetacei, nessun segnale legato alla storia della specie o al cuscinetto cromosomico poteva essere visto negli altri Cetartiodactyla. Quindi, il segnale filogenetico legato alla storia della specie sembra rafforzarsi man mano che si segue l’albero dai Cetartiodactyla verso i primati. Questa persistenza parziale, omoplasica, del segnale filogenetico può essere spiegata dall’influenza della regione che circonda l’inserzione. Questo potrebbe essere il risultato dell’età avanzata dell’inserzione (74-87 myrs ). La successiva perdita di omologia potrebbe aver dato luogo a un’evoluzione più divergente tra i cromosomi in alcuni taxa (Cetacea) che in altri (Artiodactyla).

Sarebbe interessante studiare questa regione a livello di intero clade combinando i caratteri di sequenza e indel nella stessa analisi. Questo potrebbe fornire indizi per testare le molte ipotesi sulla radiazione basale dei Cetartiodactyla (ad esempio). Data la posizione presumibilmente basale dei Suioidea e Tylopoda nella filogenesi dei Cetartiodactyla ( e Fig. 3), ipotizziamo che il principale evento evolutivo rappresentato dall’inserzione (illustrato da una freccia Figura 4a) si è verificato una volta nel clade Cetacea-Ruminantia e non nei restanti Cetartiodactyla.

La presenza di questa grande inserzione nella copia Amel-Y può essere utile per la determinazione del sesso.

La storia evolutiva indica anche che la nostra tecnica di sessaggio è applicabile, oltre che ai cetacei, a più di una vasta gamma di specie di Cetartiodactyla comprese le specie domestiche e selvatiche, in particolare i diffusi Ruminantia (Bovidae, Capridae e molto probabilmente Cervidae). Tuttavia non è adatto ai Suiformes e sono necessari ulteriori studi per confermare che la tecnica non è applicabile anche ai Camelidae, data la loro posizione ancora più basale nella filogenesi dei Cetartiodactyla.

Uso nella valutazione dei pedigree e nella genetica delle popolazioni

Nei delfini, i frammenti Amel-Y amplificati con la coppia di primer SC1-SC2 sono stati facilmente sequenziati senza bisogno di clonazione poiché l’amplificazione era specifica del cromosoma Y. Dai dieci campioni di delfino striato sequenziati, nove erano maschi, e abbiamo potuto dedurre sette distinti aplotipi Y (un aplotipo rappresentato da tre individui e quattro aplotipi individuali) con 64 siti polimorfici (diversità nucleotidica π = 0,004 ± 0,0007). La metà di questi erano nell’inserzione ~ 460 bp. Un allineamento dei siti polimorfici è presentato nella Figura 5 (a). Sorprendentemente, queste sequenze hanno mostrato due aplogruppi altamente divergenti, divergenti da una media di 49 sostituzioni. Questo concorda con i nostri risultati che supportano la probabile esistenza di due sottospecie nel Mediterraneo (dati non pubblicati). Inoltre, uno di questi aplogruppi mostra un alto grado di polimorfismo, con 24 siti informativi, mentre gli altri ne mostrano solo otto. Questi valori sono sufficienti per l’uso nell’analisi dei pedigree e nella genetica delle popolazioni, come la controparte cromosomica Y del d-loop mitocondriale in questa specie. Infatti, nel delfino striato la divergenza intraspecifica (intergruppo) è maggiore di quella interspecifica con una media di 45 sostituzioni nucleotidiche tra le sequenze del delfino striato e della balenottera comune. C’è una media di 0,048 ± 0,01 sostituzioni per sito quando si confrontano le due popolazioni di delfino striato. Questo è paragonabile alla divergenza osservata tra ogni popolazione e il delfino comune (0,058 ± 0,03) e conferma che la diversità nucleotidica è di un ordine di grandezza superiore al range osservato (10-4) per i marcatori del cromosoma Y nei mammiferi. Come per il d-loop mitocondriale, la dimensione del frammento amplificato limita leggermente l’uso della tecnica. Alcuni campioni degradati non si amplificano; anche così, un campione di capodoglio particolarmente degradato era ancora amplificabile (dati non mostrati).

Poiché la popolazione del cromosoma Y dovrebbe avere una piccola dimensione effettiva, è più probabile che sia influenzata dalla deriva genetica. Quindi, riflette eventi demografici più recenti come colli di bottiglia, espansioni o effetti fondatore. Per studiare questo tipo di eventi, si ha bisogno di un marcatore la cui diversità è abbastanza alta da permettere la ricostruzione di genealogie con la minima ambiguità e in regioni dove la ricombinazione non interferisce con l’unicità degli alberi. A questo scopo, i microsatelliti altamente variabili rappresentano marcatori preziosi, ma richiedono metodi di calcolo intensivi per tenere conto delle incertezze negli alberi derivanti da alleli che sono identici per stato e non per discendenza (omoplasie) . L’aggiunta di un nuovo marcatore di sequenza è quindi interessante per la genetica di popolazione del cromosoma Y nei Cetartiodactyla. Inoltre, la stima bayesiana del tasso di mutazione su ogni bordo di entrambi gli alberi in Fig. 4, calcolata congiuntamente all’inferenza filogenetica, mostra valori elevati per un marcatore del DNA nucleare: tra 10-8 e 10-10 sostituzioni per sito e per anno in tutti i rami di Cetartiodactyla. Questo valore è intermedio tra quelli del d-loop mitocondriale e del DNA nucleare nei mammiferi.

Prospettive funzionali nell’evoluzione dell’amelogenina

Abbiamo trovato due codoni di stop nelle posizioni aminoacidiche 98 e 99 dell’esone 5 in tutte le copie del cromosoma Y di amelogenina nelle quattro specie di cetacei studiate (posizioni 988-993 della sequenza EMBL:AM744959). Il prodotto del gene Amel-Y potrebbe quindi essere troncato in queste specie o rappresentare uno pseudogene come già osservato nelle specie della maggior parte degli altri cladi euteri

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