Variazioni nel ciclo di Calvin-Benson: pressioni di selezione e ottimizzazione?

Il ciclo di Calvin-Benson è la base della fissazione del carbonio in tutti gli organismi fotosintetici. Tuttavia, si sa relativamente poco sulla misura in cui il suo funzionamento varia tra le specie. Utilizzando un approccio di profilazione dei metaboliti, abbiamo scoperto differenze nei livelli di intermedi chiave del ciclo di Calvin-Benson tra le specie C3 e C4. Queste differenze nei pool di metaboliti sono state osservate tra le specie C3 e tra le piante C3 e C4. Questo lavoro solleva l’interessante possibilità che le diverse pressioni di selezione sui componenti del ciclo di Calvin-Benson abbiano portato alla sua ottimizzazione indipendente tra le specie.

Nel 1954, Melvin Calvin, Andrew Benson e James Bassham pubblicarono la via metabolica usata per fissare la CO2 atmosferica – il ciclo di Calvin-Benson (Bassham et al., 1954). Le loro scoperte fondamentali si basavano sull’alimentazione dell’alga Chlorella con CO2 marcato con 14C e tracciando l’etichettatura dei metaboliti nel tempo (Bassham et al., 1954; Sharkey 2018). Hanno scoperto che il ciclo è composto da tre fasi: in primo luogo, l’enzima ribulosio-1,5-bisfosfato carbossilasi/ossigenasi (Rubisco) fissa la CO2 usando il ribulosio-1,5-bisfosfato (RuBP) come accettore, producendo due molecole a 3 carboni, 3-fosfoglicerato (3-PGA). In secondo luogo, l’ATP e il NADPH generati durante la catena di trasporto degli elettroni fotosintetici (le reazioni dipendenti dalla luce della fotosintesi) sono usati per fosforilare e successivamente ridurre il 3-PGA a triosio fosfato (triosio-P). In terzo luogo, l’accettore di CO2 RuBP viene rigenerato attraverso una serie di reazioni (Box 1). La maggior parte degli enzimi coinvolti in questo ciclo sono stati scoperti prima o subito dopo (Horecker et al. 1951; Racker et al., 1953; Mayoudan et al., 1957). Da allora, si è generalmente assunto che il funzionamento del ciclo di Calvin-Benson è altamente conservato tra le diverse specie di piante.

Box 1.

Il ciclo di Calvin-Benson

Il ciclo di Calvin-Benson è composto da tre fasi: (1) fissazione del carbonio, (2) riduzione e (3) rigenerazione dell’accettore di CO2.

La carbossilazione si ottiene tramite la ribulosio-1,5-bisfosfato carbossilasi/ossigenasi (Rubisco), che fissa la CO2 usando il ribulosio-1,5-bisfosfato (RuBP) come accettore e così facendo produce due molecole di 3-carbonio di 3-fosfoglicerato (3-PGA). Il 3-PGA viene successivamente fosforilato dalla fosfoglicerato chinasi (PGK) e ridotto a triosio fosfato (triosio-P) dalla gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi (GAPDH) nella fase di riduzione. Il ciclo utilizza 3 ATP e 2 NADPH per ogni molecola di CO2 fissata. Il triosio-P può essere trasportato fuori dal cloroplasto per produrre saccarosio nel citosol. Il fruttosio 1,6-bisfosfato aldolasi (FBP ald) può convertire il triosio-P in fruttosio-6-fosfato (F6P), l’intermedio usato per produrre amido. Inoltre, il triosio-P può essere convertito in RuBP in una serie di reazioni di rigenerazione per fissare più molecole di CO2.

Abbreviazioni: fruttosio-1,6-bisfosfato (FBP), fruttosio-1,6-bisfosfatasi (FBPase), eritrosio-4-fosfato (E4P), sedoeptulosio 1,7-bisfosfato aldolasi (SBP ald), sedoeptulosio-1,7-bisfosfato (SBP), sedoeptulosio-1,7-bisfosfatasi (SBPase), sedo-eptulosio-7-fosfato (S7P), transketolasi (TK), ribosio-5-fosfato (R5P), xilulosio-5-fosfato (Xu5P), ribosio-5-fosfato isomerasi (RPI), ribulosio-5-fosfato epimerasi (RPE), ribulosio-5-fosfato (Ru5P), fosforibulokinasi (PRK). Gli enzimi che catalizzano reazioni irreversibili sono evidenziati da una pesante freccia in grassetto (cioè Rubisco, FBPasi, SBPasi e PRK).

Nella grande maggioranza delle piante terrestri, insieme alle reazioni fotosintetiche dipendenti dalla luce, il ciclo di Calvin-Benson è condotto principalmente nelle cellule del mesofillo delle foglie. Tuttavia, la Rubisco discrimina male tra CO2 e O2 (Bowes et al., 1971) e fissando una molecola di O2 invece di CO2 si ha la fotorespirazione – una via di recupero energeticamente costosa per recuperare la RuBP. Dopo che la concentrazione atmosferica di CO2 è scesa drasticamente 2,3 miliardi di anni fa (Bekker et al., 2004), due meccanismi di concentrazione del carbonio si sono evoluti, limitando la quantità di fotorespirazione. Queste modifiche al processo fotosintetico di base, la fotosintesi C4 e il metabolismo degli acidi crassulacei (CAM), sono sorte ciascuna più volte (Sage et al., 2011). La fotosintesi C4 comporta la separazione spaziale della fotosintesi in modo che i componenti delle reazioni dipendenti dalla luce e il ciclo di Calvin-Benson avvengano nel mesofillo e nelle cellule della guaina fittonante (Box 2). Nonostante le differenze nella localizzazione anatomica della fissazione del carbonio, finora si sapeva poco su come il funzionamento del ciclo di Calvin-Benson possa essere diverso nelle piante C4 rispetto alle C3 e anche tra le piante C3.

Box 2.

Il meccanismo di concentrazione del carbonio nelle piante C4

Nel 1966, Hal Hatch e Roger Slack scoprirono la fotosintesi C4 (Hatch e Slack, 1966), che comporta un meccanismo di concentrazione del carbonio aggiunto alla normale via di fissazione del carbonio C3. Hanno usato la marcatura 14C per dimostrare che la CO2 nelle foglie di canna da zucchero è stata prima fissata in un acido a 4 carboni, piuttosto che in 3-fosfoglicerato (3-PGA) come nelle piante C3. Le piante C4 usano la fosfoenolpiruvato carbossilasi (PEPC) come enzima iniziale di fissazione del carbonio nelle cellule del mesofillo. L’acido 4-carbonio (malato o aspartato a seconda del tipo di fotosintesi C4) prodotto nelle cellule del mesofillo entra poi nelle cellule della guaina del fascio, dove viene decarbossilato e viene liberata CO2. Questo meccanismo di concentrazione del carbonio permette alla Rubisco di agire quasi esclusivamente come carbossilasi durante il ciclo di Calvin-Benson nelle cellule della guaina. Oltre a una riconfigurazione degli enzimi metabolici esistenti, il percorso C4 richiede lo sviluppo di un’anatomia fogliare specializzata (anatomia di Kranz) che include un aumento della spaziatura delle vene e delle dimensioni delle cellule della guaina. Classicamente, sono stati riconosciuti tre diversi tipi di fotosintesi C4, dal nome dell’enzima primario responsabile della reazione di decarbossilazione nelle cellule della guaina dei fasci: NAD-ME, NADP-ME o tipo PEPCK. Abbreviazioni: anidrasi carbonica (CA), ossalacetato (OA), malato deidrogenasi dipendente dal NADP (NADP-MDH), malato (M), enzima malico dipendente dal NADP (NADP-ME), piruvato (Pyr), piruvato, ortofosfato dikinasi (PPDK), fosfoenolpiruvato (PEP).

Variazione dei metaboliti del ciclo di Calvin-Benson tra le specie

Il ciclo di Calvin-Benson è senza dubbio una delle vie biochimiche più critiche sulla terra, come la via di assimilazione del carbonio nelle piante – il cuore della fotosintesi. Ma tutte le specie di piante eseguono questo percorso allo stesso modo? Arrivault et al. (2019) hanno profilato l’abbondanza di metaboliti del ciclo di Calvin-Benson da cinque piante C3 (tra cui Arabidopsis e diverse importanti colture come riso, grano e manioca) e quattro piante C4 (tra cui il mais). I metaboliti totali sono stati estratti dalle foglie mature e misurati usando la cromatografia liquida in fase inversa accoppiata alla spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS). Per una quantificazione affidabile, i campioni sono stati sottoposti a spikeing con standard metabolici interni marcati con isotopi; il 3-PGA è stato quantificato enzimaticamente. I profili dei metaboliti delle diverse specie di piante sono stati confrontati utilizzando l’analisi delle componenti principali.

Sorprendentemente, Arrivault et al. (2019) hanno scoperto differenze sostanziali nei profili dei metaboliti degli intermedi del ciclo di Calvin-Benson tra le cinque specie C3 che hanno studiato. Gli intermedi che variavano maggiormente includevano i livelli assoluti di 3-PGA, triosio-P, ribulosio-5-fosfato (Ru5P) e xilulosio-5-fosfato (Xu5P). I livelli relativi di RuBP rispetto ai livelli di intermedi coinvolti nella rigenerazione di RuBP erano variabili tra le specie. Inoltre, gli autori hanno dimostrato la variabilità nei livelli relativi di coppie di metaboliti come il fruttosio-1,6-bisfosfato (FBP) e il fruttosio-6-fosfato (F6P), che sono legati attraverso la reazione irreversibile della FBPasi; e nella coppia di metaboliti sedo-eptulosio-1,7-bisfosfato (SBP) e sedo-eptulosio-7-fosfato (S7P), che sono irreversibilmente interconvertiti dalla SBPasi. Nella maggior parte dei casi, le cinque specie C3 si sono separate chiaramente l’una dall’altra nell’analisi delle componenti principali. La misura in cui si separavano dipendeva dal fatto che i dati fossero normalizzati al peso fresco, al contenuto di clorofilla o al contenuto di proteine. La variazione di questi intermedi all’interno delle cinque specie C3 indica delle differenze nel modo in cui le piante eseguono lo stesso percorso di fissazione del carbonio. Queste informazioni hanno conseguenze per le strategie che mirano a migliorare la fotosintesi. Per esempio, SBPase può limitare il tasso di fotosintesi (Zhu et al., 2007) e la sovraespressione può aumentare l’efficienza fotosintetica (Lefebvre et al., 2005; Feng et al. 2007; Ding et al., 2016; Driever et al., 2017). Quindi, alterare l’attività di un singolo enzima nel ciclo di Calvin-Benson può avere un impatto sul tasso di fotosintesi, e successivamente sulla biomassa e sulla resa. Tuttavia, l’efficacia di questo approccio è nota per variare tra le specie. La variazione preesistente dei livelli dei metaboliti SBP e S7P tra le specie C3 riportata da Arrivault et al. (2019) è quindi importante e può fornire una visione della risposta variabile della fotosintesi all’aumento delle quantità di SBPasi.

Siccome il meccanismo di concentrazione del carbonio delle piante C4 limita la fotorespirazione, era forse meno sorprendente che il primo prodotto della fotorespirazione, il 2-fosfoglicolato (2-PG), fosse meno abbondante nelle specie C4 che nelle specie C3. Inoltre, le piante C4 avevano livelli più bassi di RuBP rispetto alle piante C3, coerentemente con il loro minore investimento in Rubisco. Tuttavia, anche quando i livelli di 2-PG e RuBP sono stati omessi dal set di dati, i livelli di metaboliti C3 e C4 si sono quasi sempre separati nell’analisi delle componenti principali. Queste differenze erano coerenti, indipendentemente dal fatto che i dati fossero normalizzati al peso fresco, al contenuto di clorofilla o al contenuto proteico, e quindi i cambiamenti indicano che gli enzimi responsabili della generazione dei metaboliti stanno intraprendendo la catalisi a tassi diversi nelle diverse specie. Gli autori hanno coniato il termine “modalità di funzionamento” del ciclo di Calvin-Benson per descrivere queste differenze – in modo tale che il ciclo funziona in modo diverso tra le specie anche se gli stessi enzimi sono coinvolti, portando alle alterazioni osservate nei livelli relativi di intermedi. Essi propongono quindi che le differenze nel ciclo di Calvin-Benson tra le piante C3 e C4 sono più ampie di un semplice trasferimento spaziale nelle cellule della guaina dei fasci, e coinvolgono un adattamento nella modalità di funzionamento del ciclo.

Prospettive future

Stabilire che la modalità di funzionamento del ciclo di Calvin-Benson può variare è interessante, soprattutto considerando che la struttura del percorso (in termini di enzimi coinvolti e la loro sequenza di reazione all’interno del ciclo) è stata altamente conservata. Tuttavia, nel corso dei milioni di anni dalla prima apparizione del ciclo, il rapporto tra O2 e CO2 nell’atmosfera è cambiato radicalmente. Si pensa che questi cambiamenti abbiano contribuito all’evoluzione di alcune specie di piante in meccanismi di concentrazione del carbonio. Gli autori propongono ora che i bassi livelli di CO2 in combinazione con specifiche condizioni ambientali possono aver portato allo sviluppo di diverse modalità di funzionamento del ciclo di Calvin-Benson. Così, la variazione nei profili dei metaboliti osservati potrebbe riflettere pressioni di selezione distinte su come il ciclo di Calvin-Benson è regolato in diversi lignaggi di piante. Il metodo usato dagli autori per analizzare gli intermedi del ciclo di Calvin-Benson potrebbe ora essere applicato a più specie, e questo sarebbe particolarmente interessante se queste coprissero una gamma più ampia di famiglie di piante in ambienti diversi. Questo potrebbe rivelare se la variazione segue strettamente i taxa filogenetici o gli ambienti specifici a cui le piante si sono adattate.

Inoltre, le piante C4 analizzate in Arrivault et al. conducono tutte il tipo NADP-ME di fotosintesi C4. Quindi, una linea promettente di ulteriori studi sarebbe quella di esplorare se cambiamenti simili negli intermedi del ciclo di Calvin-Benson sono osservati in tutti e tre i tipi di metabolismo C4, o se sono specifici del tipo NADP-ME.

Questo lavoro è un eccellente punto di partenza per scoprire come queste diverse modalità del ciclo di Calvin-Benson sono controllate a livello molecolare. Mentre il profilo dei metaboliti permette un approccio imparziale per valutare la variazione dei livelli di intermedi tra le diverse specie, le cause sottostanti a queste differenze rimangono da determinare. La variazione tra le specie potrebbe derivare da differenze nell’espressione genica e nelle successive attività della proteina, dalla variazione nella sequenza degli aminoacidi che influisce sulla cinetica o dalla regolazione post-traslazionale degli enzimi. In particolare, quasi tutti gli enzimi del ciclo di Calvin-Benson sono soggetti ad almeno qualche forma di regolazione redox, per lo più attraverso il sistema della tioredossina (TRX)/ferredossina (Fd) (Buchanan e Palmer, 2005; Michelet et al. 2013). L’integrazione di questi dati di trascrizione, abbondanza proteica e attività enzimatica ai livelli di metaboliti può rivelare la base molecolare della variazione. Inoltre, le variazioni osservate nei pool di metaboliti possono anche essere legate alla richiesta di alcuni intermedi, in particolare quelli che vengono ritirati dal ciclo di Calvin-Benson. Ad esempio, il flusso attraverso il ciclo può essere influenzato dalle vie di uscita per consentire la sintesi di amido (tramite F6P), saccarosio e isoprenoidi (tramite triosio-P), aminoacidi tramite la via shikimate (tramite E4P), nonché tiamina e nucleotidi (tramite R5P) (Raines, 2011).

Arrivault et al. (2019) riportano interessanti variazioni su come i componenti del ciclo di Calvin-Benson operano in diverse specie vegetali. Questo sicuramente catalizzerà ulteriori studi su come le piante hanno adattato questo fondamentale e antico percorso di fissazione del carbonio a diversi ambienti.

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