Konvexní Arrheniovy grafy a jejich interpretace

V posledních letech se ve stále větším počtu studií měří teplotní závislost enzymových reakcí jak u termostabilních, tak u mezostabilních enzymů (enzymů z organismů, které optimálně rostou při vysoké teplotě, resp. při normální teplotě těla). Teplotní závislost se obvykle zobrazuje v Arrheniově grafu, což je přirozený logaritmus rychlostního koeficientu v závislosti na reciproké hodnotě absolutní teploty (obr. 1). Některé z metodik měření teplotních závislostí reakčních rychlostí byly použity také k měření teplotních závislostí kinetických izotopových efektů (KIE) katalyzovaných reakcí a tyto experimenty poskytují experimentální údaje velmi důležité pro charakterizaci dynamických úzkých míst reakcí (1-6). Pro interpretaci tohoto druhu dat bylo navrženo velké množství teoretických modelů (7-19).

Experimenty na reakcích katalyzovaných řadou termostabilních a mezostabilních enzymů dehydrogenas a oxidas ukázaly, že v některých případech je Arrheniův graf pro chemický krok konvexní (20-23). V tomto článku komentujeme význam tohoto pozorování a poskytujeme interpretaci tohoto zjištění, která jej zasazuje do širší perspektivy nebiologické chemické i biochemické kinetiky. Tento článek poukazuje na to, že konvexní Arrheniovo chování klade přísné omezení na mikrokanonický unimolekulární rychlostní koeficient pro chemický krok. Zejména můžeme překročit zřejmou interpretaci, že konvexní Arrheniův graf lze interpretovat jako nižší než očekávanou rychlost při vysokých teplotách, a můžeme za určitých podmínek říci, že mikrokanonický unimolekulární rychlostní koeficient pro chemický krok musí ve skutečnosti s rostoucí energií klesat.

Obecně je žádoucí rozdělit interpretaci experimentálních dat do dvou kroků. Nejprve vyvodíme obecné důsledky, které se opírají o pevné základy, jako je termodynamika a obecné principy statistické mechaniky. Za druhé přejdeme k podrobnějším mikroskopickým modelům, které spočívají na méně jistých základech. Nový aspekt této analýzy se týká výhradně prvního kroku.

Nápadným rysem reakcí v refs. 20-23, které zde diskutujeme, je kladná konvexita C jejich Arrheniových grafů, kde 1 k(T) je katalytický rychlostní koeficient a T je teplota. Píšeme 2 kde 3 Ea je fenomenologická aktivační energie závislá na teplotě a R je plynová konstanta. Kladná konvexita tedy znamená, že Ea s rostoucí teplotou klesá. V široké oblasti kinetiky, přičemž se neomezujeme na úvahy o enzymové kinetice, pokud lze pozorovat nelineární Arrheniovy grafy, jsou téměř vždy konkávní, tj. hodnota C je záporná. Tento obecný výsledek vysvětluje Tolmanova interpretace aktivační energie, kterou lze zapsat jako (25-27) 4 , kde dvojité převýšení označuje průměr za všechny reagující systémy a jednoduché převýšení označuje průměr za všechny systémy, ať už reagují nebo ne. Slovy Tolmanova rovnice 4 říká, že záporný lokální sklon Arrheniova grafu lze interpretovat jako rovný průměrné energii molekul, které reagují, minus průměrná energie všech možných reaktantů. Pro jednomolekulární reakce tepelně vyrovnaného druhu: 5 a 6 kde E je celková energie, dP/dE je normalizovaná hustota pravděpodobnosti, že systém má energii E v kanonickém souboru při teplotě T, a k(E) je koeficient unimolekulární rychlosti pro mikrokanonický soubor při energii E.§ Obvykle E̿ roste s rostoucí T rychleji než Ē, protože k(E) je obvykle rostoucí funkcí energie.¶ To vysvětluje, proč Ea obvykle roste s T, a tedy proč je C záporné. Konvexní Arrheniův graf znamená, že E̿ s rostoucí teplotou klesá nebo že roste méně rychle než Ē, a v dalším odstavci tvrdíme, že to obvykle znamená, že k(E) s rostoucí energií klesá v oblasti energie, která dominuje integrálům v rovnici 6.

Jednou lze učinit přesnější prohlášení o důsledcích toho, že E̿ s rostoucí teplotou klesá nebo roste méně rychle než Ē. Poznamenáním, že 7 kde β je 1/RT a ρ(E) je hustota stavů, a použitím rovnic 4-6 lze snadno ukázat, že 8 Tvrzení, že dEa/dT je záporné, je tedy stejné jako tvrzení, že rozdělení reakčních energií je užší než rozdělení energií reaktantů. Pokud by dP/dE bylo symetrické kolem Ē, pak by znaménko dEa/dT záviselo na tvaru funkce k(E), a ne jen na jejím znaménku. Ale dP/dE je ve skutečnosti silně zkreslená funkce. Pro typické molekuly se její tvar dobře aproximuje stanovením ρ(E) v rovnici 7 na hodnotu En-1, kde n je přibližně rovno počtu stupňů volnosti (31). Pokud přijmeme tento tvar a také předpokládáme, že k(E) se mění pomalu a lineárně v důležitém rozsahu integrálů v rovnici 6, lze ukázat, že pravá strana rovnice 8 je úměrná dk/dE s kladnou konstantou úměrnosti. Pro složitější funkce k(E) již nemáme k dispozici přesnou úměrnost, ale směr účinku je stanoven kladnou šikmostí dP/dE. Ačkoli totožnost znamének dEa/dT a dk/dE není matematická věta, očekává se, že bude platit pro normální hustoty stavů a hladké funkce k(E).

Tento výsledek představuje omezení pro jakoukoli mikroskopickou interpretaci a – což je stejně důležité – navrhuje nové mikroskopické interpretace. Předpokládejme například, že konfigurační prostor reaktantu lze rozdělit na dva typy konformací, z nichž jedna (nazývaná typ R) je reaktivní s koeficientem rychlosti kR(E) a druhá (nazývaná typ N) je nereaktivní s nulovým koeficientem rychlosti. Pak 9 kde PR(E) je podmíněná pravděpodobnost, že systém s energií E je v konformaci typu R. To poskytuje mechanismus pro pokles k(E) s E, tj. PR(E) klesá s E rychleji, než roste kR(E). K tomu by mohlo dojít proto, že systémy s vyšší energií navštěvují širší oblast fázového prostoru, a tudíž tráví menší část svého času v jedné omezené oblasti. Tato interpretace může mít zvláštní význam pro enzymologii. V posledních letech se několik studií zabývalo pochopením úlohy konformačního vzorkování v enzymové katalýze (17, 18, 22, 32-37). V nedávném přehledu Bruice a Benkovic (17) tvrdili, že aktivní konfigurace vzorkované enzymatickým komplexem nemají vyšší energii než obecná populace konformerů a že obsazení těchto konformací může určovat rychlost reakce. Na rozdíl od někdy podrobných modelů v citovaných pracích vychází současný výklad z velmi obecných základů, aniž by se odvolával na konkrétní mikroskopický molekulární mechanismus nebo model, jako je tunelování podporované tepelně excitovanými fluktuacemi enzymu (11, 13, 38, 39), výpočty volné aktivační energie zahrnující vlastní vzorek nad konformacemi (40) nebo specifické mechanismy přechodů mezi mikrostavy s různou konformační flexibilitou (41-44). Nicméně může zjevně pojmout specifičtější interpretace, jako je protein, který je rigidní při nízké T, nebo dynamický pohyb, který vyžaduje populaci specifických nízkoenergetických vibračních stavů. Nic z toho, co jsme zde uvedli, však neposkytuje konkrétní podporu takovým modelům, jejichž platnost by měla být prověřena dalšími experimenty a podrobnými simulacemi. Tato diskuse se konkrétně nedovolává efektů spojených s rozpadem teorie přechodných stavů. Kvantové efekty, jako je tunelování, lze zohlednit prostým zahrnutím do k(E) nebo kR(E).

V kontextu naší analýzy lze výše uvedené výsledky pro termofilní alkoholdehydrogenázu ADH-hT (22, 32) interpretovat z hlediska relativních trendů E̿ a Ē při změně teploty. Všeobecně rozšířenou hypotézou je, že termofilní enzymy se vyvinuly tak, aby fungovaly ve své fyziologické nice, tj. při zvýšené teplotě, a jsou méně aktivní při pokojové teplotě (v některých případech dokonce méně aktivní, než se předpokládá podle jejich aktivační entalpie při fyziologické teplotě). Naše analýza může nabídnout spojení mezi touto představou a výpočty zabývajícími se identifikací aktivních a neaktivních konformací (16, 17). Wrba a spol. například (21) uvedli empirické pozorování, že u enzymů s různými teplotami tání je rozdíl teplot maximálního zakřivení v Arrheniových grafech podobný rozdílu teplot tání. To může souviset s posuny závislostí PR(E) a kR(E) na E v rozmezí, které je důležité při přechodových teplotách pro denaturaci a aktivitu. Jako další příklad uvádíme, že nedávno bylo naznačeno, že „možná není překvapivé, že pro reakce štěpení C-H vazeb je hlavním faktorem rozdělení tepelné energie do nízkofrekvenčních proteinových módů. Tyto módy mohou být při okolní teplotě výrazně excitovány, na rozdíl od módu protažení C-H, který by měl být do značné míry omezen na svou energetickou hladinu nulového bodu“ (22). Tyto druhy úvah mohou souviset s teplotní závislostí E̿ a Ē, a tedy s konkávností nebo konvexností Arrheniových grafů.

Obecný závěr o energetické závislosti mikrokanonického rychlostního koeficientu platí i pro konvexní Arrheniovy grafy, které jsou občas pozorovány v jiných studiích. Pokud chceme použít tyto argumenty, musíme být opatrní, abychom se ujistili, že konvexní Arrheniův graf představuje skutečnou elementární reakci s vnitřně vyrovnanými reaktanty. Například v prototypové úloze ustáleného stavu 10 , kde 11 s 12 lze použít pro k1, k-1 nebo k2, ale ne obecně pro k. Pokud jsou však k-1 a k1 mnohem větší než k2, pak se k stává elementárním rychlostním koeficientem pro A → C a žádné závěry se před rovnovážným krokem určujícím rychlost nemění. To dále platí pro případ, kdy je k2 mnohem větší než k1 a k-1, kdy se k stává k1. Zvláštním případem, kdy lze použít přístup založený na ustáleném stavu, je případ, kdy A odpovídá nenavázanému reaktantu a enzymu, stav B je Michaelisův komplex a stav C je produkt (45). Všimněte si, že v tomto případě by k1 (v rovnici 12) měla být rychlostní konstanta druhého řádu vedoucí k Michaelisově rovnici: 13 kde je koncentrace reaktantu (substrátu), Vmax je rychlost reakce při mnohem vyšší hodnotě než KM, což je Michaelisova konstanta, (k2 + k-1)/k1, pro rovnici 10. Tato diskuse se nevztahuje na efektivní rychlostní koeficienty vyplývající ze změny kroku určujícího rychlost nebo na změny efektivní koncentrace enzymu , ani na rychlostní koeficienty s hysterezí způsobenou tvorbou skla. Tento bod je třeba zdůraznit u enzymatických reakcí: představují naměřené rychlosti skutečně smysluplnou konzistentní rychlostní konstantu v celém teplotním rozsahu? Například v dřívější zprávě o konvexním Arrheniově grafu pro termofilní alkoholdehydrogenázu z Bacillus stearothermophilus (ADH-hT) byla všechna měření provedena se stejnou koncentrací substrátu (tedy nasycením enzymu při pokojové teplotě) a byla prezentována Vmax (47). Pozdější zpráva (22) zjistila, že KM roste s teplotou, takže při vysoké teplotě nebyla dostatečně větší než KM, a bylo zjištěno, že naměřená rychlost je pomalejší než Vmax, což představovalo zřejmě konvexní Arrheniův graf. I pro nejjednodušší realistickou enzymovou kinetiku by měl být mechanismus 10 rozšířen o krok uvolňování produktu a data by měla být analyzována s náležitým ohledem na závazek ke katalýze a poměr katalýzy (48, 49); jinak může naměřená kcat vykazovat jinou teplotní závislost než vlastní k2. Ref. 20-24 byly vybrány jako příklady, u nichž byla věnována zvláštní pozornost tomu, aby bylo zajištěno a prokázáno, že Arrheniův graf odpovídá jedinému rychlost limitujícímu kroku elementární chemické reakce v závislosti na teplotě. Rubach a Plapp (osobní sdělení nepublikovaných výsledků) například použili techniky zastaveného toku před ustáleným stavem k měření KIE na mikroskopických rychlostních konstantách při studiu reakce katalyzované alkoholdehydrogenázou koňských jater. Zjistili konvexní Arrheniovy grafy pro přenos hydridů i deuteridů, ale žádnou teplotní závislost KIE, a prokázali, že žádná změna v kroku určujícím rychlost pravděpodobně neovlivní jejich výsledky. Dále jsme vyloučili případy, pro které teplotní rozsah umožňuje nevratně roztavený nebo částečně roztavený protein. Na rozdíl od enzymových příkladů vykazujících konvexní Arrheniovo chování zahrnující jediný elementární krok uvádíme případ permeace léčiv kůží, kde bylo pozorováno konvexní Arrheniovo chování, ale kde elementární kroky nebyly nebo nemohly být vytříděny (50, 51). Pro srovnání s prostupem kůží uvádíme také, že poněkud lépe definovaný případ ne-Arrheniovy teplotní závislosti difúze v amorfních pevných látkách byl modelován vícekrokovým modelem site-hopping (52, 53).

Užitečnou ilustraci těchto pojmů poskytuje příklad z organické chemie ve spojení se strukturní reorganizací závislou na teplotě. Limbach pozoroval konvexní Arrheniovy grafy (osobní sdělení nepublikovaných výsledků) pro bází katalyzovaný intramolekulární přenos protonu v 1,3-bis-(4-fluorofenyl)-triazenu rozpuštěném v ethylmethyletheru . Rychlostní koeficient představuje průměr pro různé vodíkově vázané formy reaktantu, zejména volnou molekulu a komplex s bází. Přenos protonu probíhá v komplexu. Vypouklé Arrheniovo zakřivení vyplývá ze skutečnosti, že molekula přechází při vysoké teplotě do nekomplexní formy, kde je bariéra pro přenos protonu větší (cit.55 a H. H. Limbach, osobní sdělení). Tolmanova interpretace tedy neplatí striktně, protože rychlostní koeficient nepředstavuje jediný elementární krok. Arrheniův graf reakce z obou forem zvlášť by byl pravděpodobně kvazilineární nebo konkávní. Pokud se však různé formy s vodíkovou vazbou považují za konformery jediného reaktantu, lze použít Tolmanovu interpretaci, která poskytuje ilustraci molekuly, která reaguje pomaleji při vyšší energii, protože zkoumá širší oblast fázového prostoru, která zahrnuje v podstatě nereaktivní konformery. Podobně Massey a spol. (23) navrhují možné vysvětlení svého konvexního Arrheniova grafu zahrnující dvě konkurenční enzymatické formy, z nichž každá dominuje v jiném teplotním rozsahu. Tento model je jedním z konkrétních příkladů modelu, který by mohl být v souladu se zde prezentovaným výsledkem nezávislým na modelu. U nebiologických reakcí očekáváme, že zvláště reaktivní konfigurace budou často vysokoenergetickými druhy. Je možné, že konvexní Arrheniovy grafy budou častější v biologických systémech, protože enzym se mohl specificky vyvinout tak, že nejnižší energetické stavy (tj. ty nejdostupnější při okolní T) jsou reaktivní, což vede k nízkým E̿ i při zvyšování T.

Konvexní Arrheniovy grafy byly také pozorovány pro difuzi v přechlazených kapalinách a sklech. Takové případy, stejně jako výše zmíněný problém permeace kůží, mohou být komplikovány více paralelními cestami, ale přesto se podrobily podrobné analýze. Jedním z hojně citovaných vysvětlení je, že molekuly v kapalinách o nízké teplotě difundují překonáváním znatelných potenciálových bariér, zatímco při vysoké teplotě jsou difuzní pohyby téměř volné (24, 56). Tento model uznává, že se zvyšující se teplotou se tepelné energie zvětšují v porovnání s výškou bariér; pro konvexní Arrheniův graf je nutné, aby průměrná energie molekul provádějících přechody (v tomto případě difúzní přeskoky z jednoho lokálního minima do druhého) rostla pomaleji než průměrná energie všech molekul. Existuje mnoho podrobných teorií ne-Arrheniova chování v metastabilních kapalinách a sklech, které se explicitně nezabývají teplotní závislostí aktivační energie ve smyslu Tolmanovy interpretace (58), ale každé konzistentní vysvětlení konvexního Arrheniova grafu ve smyslu lokálních rovnovážných elementárních rychlostních koeficientů musí být v souladu s Tolmanovým výsledkem na určité základní úrovni, i když to není explicitní nebo dokonce není rozpoznáno.

V souhrnu tento článek poukázal na základní mikrokanonickou informaci, kterou poskytuje pozorování konvexity Arrheniova grafu, ale která zřejmě nebyla dříve interpretována. Analýza má širokou použitelnost a přináší určitou na modelu nezávislou předpověď o průměrných energiích systémů provádějících přechody. Výsledek je relevantní pro všechny oblasti kinetiky (v enzymech, v atmosférické chemii, v klastrových reakcích atd.), kde lze pozorovat konvexní Arrheniovy grafy, a proto jsme prezentaci ponechali co nejobecnější, přičemž jsme jako konkrétní příklady vykazující tento jev uvedli nedávné experimenty s termostabilními a mezostabilními katalyzátory dehydrogenáz a oxidáz. Uvedli jsme také souvislost s teorií difuze. Doufáme, že pohled zastávaný v tomto článku podnítí nové způsoby uvažování o reakčních rychlostech, katalýze a difúzi.

• Přijato 12. září 2000.

.