Cellekultur
Humane embryonale nyreceller 293FT (HEK293) blev dyrket i DMEM suppleret med 10 % FBS og 1 % penicillin/streptomycin (100 iU pr. ml; 100 μg pr. ml). Cellelinjerne blev ikke autentificeret. Cellerne var fri for mycoplasma. Cellerne blev inkuberet i en befugtet atmosfære med 5 % CO2 ved 37 °C. For stabile cellelinjer blev transficerede celler selekteret i tilstedeværelse af puromycin (3 μg pr. ml). Til transiente transfektionsundersøgelser blev HEK293-celler udsået i 6-well-plader i tilstedeværelse af vektorerne ved hjælp af Lipofectamin2000 (ThermoFisher). Podocytcellelinjer blev etableret fra human urin42 , og APOL1-genotypebestemmelse blev udført, efter at der var indhentet informeret samtykke i henhold til forskningsprotokoller (94-DK-0127, 94-DK-0133), der på forhånd var godkendt af NIDDK Institutional Review Board. Tilfælde A er G0/G0-mand med FSGS, tilfælde B er G0/G0-mand med HIV-associeret FSGS, tilfælde C er G0/G0-mand med FSGS (HP55-345O-1), tilfælde D er G1/G2-mand med FSGS, og tilfælde E er G1/G2-mand med HIV-associeret FSGS. Cellerne blev dyrket i RPMI1640 suppleret med 10 % FBS, ITS og 1 % penicillin/streptomycin (100 iU pr. ml; 100 μg pr. ml). Cellerne blev inkuberet i en befugtet atmosfære med 5 % CO2 ved 33 °C og differentieret ved 37 °C i 7-10 dage. Cellelinjerne blev ikke verificeret. Cellerne var fri for mycoplasma. Inden opsamling af cellelysaterne blev cellerne behandlet med 103 U pr. ml IFNα (Abcam) i 24-72 timer og 100 mM calyculin A (LC Laboratories) i 30 minutter. Til PKR-hæmmende forsøg blev cellerne behandlet med 1 μM imidazolo-oxindol PKR-hæmmer C16 (Sigma Aldrich) i 1 h43.
Menneskeligt væv
Deidentificeret humant nyrebiopsivæv blev opnået fra Dr. Preeti Chandra, University of Maryland. Forskningen blev på forhånd godkendt af Institutional Review Boards ved University of Maryland og NIDDK, NIH.
Plasmidinformation
POL1 G0-ekspressionsvektoren består af CMV-promotor afledt humant APOL1 cDNA (NM_001136540: 298-1453). For APOL1 G1 (rs73885319 A→G og/eller rs60910145 T→G) og G2 (rs71785313 del) blev der udført stedbestemt mutagenese for at fremstille den. For APOL1-ekspressionsvektor uden proteinekspression blev der fremstillet ved at indsætte et stopkodon og en frameshift-sekvens (TAATAGATGA) efter det 138. kodon. For sekundærstrukturmutationsvektoren er de oprindelige sekvenser ændret med otte synonyme ændringer (NM_001136540: 1195A→T, 1196G→C, 1197C→G, 1203A→T, 1209G→A, 1221G→A, 1224C→G og 1242T→C). For den stabile dsRNA G0-vektor er de oprindelige sekvenser ændret med 5 mutationer i 3′ UTR (CCA CAG CAG GGC AGG AGG GCA GCA GCC ACC AGG AGA GAT ATG CCT GGT GGC AGG GGC CAG GAG GAG G→CCA CAG GGC AGG CCA GCC ACC AAG AAA GAT ATG CTT GAC AGG GGC CAG G). Til flankerende RNA omkring APOL1-allelerne (NM_001136540.1, 1031-1453) blev der anvendt pRNAT-CMV3.2/Puro (GeneScript) som baggrundsvektor. Skemaer over vektorkort er i supplerende figur 1.
Immunoblotting
Cellerne blev lyseret i en RIPA-buffer, der indeholder proteaseinhibitor/phosphataseinhibitorcocktail. Lysaterne blev separeret ved SDS-polyacrylamidgelelektroforese, og proteinerne blev underkastet western blotting og blokeret i 30 min. i Odyssey-blokeringspuder (LI-COR). Blots blev inkuberet med primære antistoffer mod APOL1 (Sigma Aldrich HPA018885), phospho-eIF2α (Cell Signaling Technology #9721), eIF2α (Cell Signaling Technology #5324), β-Actin (Santa Cruz Biotechnology Inc. sc-47778), HRI (Upstate #07-728), phospho-PKR (Santa Cruz Biotechnology Inc. sc-101784), PKR (abcam ab45427), phospho-PERK (Cell Signaling Technology #3179), PERK (Cell Signaling Technology #5683), phospho-GCN (Abcam ab75836), og GCN (Cell Signaling Technology #3302), LC3 (Abcam ab168803) og p62 (Cell signaling #5114). Blots blev inkuberet med farvestofmærket anti-rabbit-antistof (LI-COR). Alle blots blev afbildet ved hjælp af Odyssey-infrarødscanneren (LI-COR). Rå gelbilleder er vist i supplerende figur 13.
Reverse transkriptase PCR og kvantitativ realtids-PCR
Celler eller total nyre blev høstet i TRIzol-reagens, og total RNA blev isoleret. Samlet RNA blev behandlet med DNase før syntese af cDNA med oligo (dT). En alikvot på 5 µg RNA blev anvendt til cDNA-syntese ved hjælp af Superscript II reverse transcriptase. Prøverne blev analyseret ved PCR (RT) eller kvantitativ RT-PCR (qRT-PCR) ved hjælp af Power SYBR Green PCR master mix (ThermoFisher). Den relative ekspression i hver prøve blev beregnet som et forhold (attamolespecifikt gen pr. β-actin). Primerpar er anført i Supplerende tabel 1.
Proteinsynteseassay
Transficerede HEK293-celler eller humane podocytcellelinjer blev dyrket i 96-hulplader og blev behandlet med 103 U pr. ml IFNα (Abcam) til kvantificering eller kammerglas til visualisering. Synteseassayet (Click-iT AHA Alexa Fluor 488 Protein Synthesis HCS Assay, katalog nr. C10289, Invitrogen) blev udført i henhold til producentens instruktion. Nuclear counter stain blev udført med Hoechst. HEK293-celler uden vektor behandlet med 1 μM puromycin (InvivoGen, San Diego, CA) blev anvendt som en negativ kontrol for dette assay, hvor baggrunden blev sat til 0 % signalintensitet. HEK293-celler med APOL1 G0-vektorceller blev indstillet som 100 % signalintensitet.
Celle-levedygtighed
Celle-levedygtighedsassays blev udført ved hjælp af ATP-assays. For at kvantificere ATP, der genereres af metabolisk aktive celler, anvendte vi et CellTiter-Glo luminescerende celleviabilitetsassay (Promega) i henhold til producentens instruktioner. Cellerne blev dyrket i sterile 96-well-plader i tilstedeværelse af 103 U pr. ml IFNα (Abcam) i 72 timer, hvorefter der blev tilsat 100 μL CellTiter-Glo-reagens for at lyse cellerne. Efter 10 minutters inkubation ved stuetemperatur blev luminescensen detekteret ved hjælp af et luminometer med en integrationstid på 1 s pr. brønd. Luminescenssignalerne for cellerne blev normaliseret med celletallet.
Celleproliferationshastighedsassay
Cellerne blev udsået med 5,0 × 103 celler pr. 150 µL kulturmedium i hver brønd i en 96-hulsplade, og PKR-inhibitor C16 blev tilsat i den angivne koncentration. Efter 0, 24, 48, 48, 50 µL blev celletallet målt ved hjælp af Cell Counting Kit-8 (Sigma-Aldrich).
Syreforbrugsrater i dyrkede humane podocytter
Den ekstracellulære fluxanalysator XF24 (Seahorse Bioscience, Billerica, MA) blev anvendt til at evaluere cellulære iltforbrugsrater (OCR) i henhold til virksomhedens anvisninger. Kort fortalt blev dyrkede humane podocytter udsået i XF24 brøndplader købt fra Seahorse Bioscience ved en tæthed på 2,0 × 104 celler pr. brønd (overfladeareal 0,33 cm2) i 100 μL kulturmedium og blev inkuberet natten over ved 37 °C. Den følgende dag blev cellerne behandlet med IFNα (1 × 103 U pr. ml) med/uden PKR-inhibitor C16 (100 nM) i 72 timer, efterfulgt af 24 timers behandling på XF24-brøndpladerne. Før OCR-målingerne blev den eksperimentelle XF24-plade med cellerne vasket med bicarbonatfrit DMEM-assaymedium (Seahorse Bioscience) indeholdende 25 mM glukose og 1 mM natriumpyruvat, og cellerne blev præinkuberet i 1 time ved 37 °C uden CO2-tilførsel i 625 μL assaymedium. Før OCR-målingerne blev XF24 kalibreret ved hjælp af en kalibreringspatron i henhold til virksomhedens anvisninger. Efter kalibreringen blev der udført baseline OCR-målinger i testpladen i 4 min.
RNA-immunopræcipitation (RNA-IP)
Stable HEK293-celler med APOL1-G0-, G1- eller G2-varianten blev mock-behandlet med følgende: (a) 103 U pr. ml IFNα i 24-72 timer og 100 μM palmitinsyre (Sigma) i 2 timer, eller (b) 100 mM 103 U pr. ml IFNα i 24-72 timer og calyculin A i 30 minutter. Palmitinsyre binder PKR direkte og hæmmer dsRNA-bindingen til PKR44 , og derfor blev palmitinsyre anvendt som negativ kontrol. Cellerne blev bestrålet med UV-lys ved 200 mJ pr. cm2. Ti procent af hvert cellelysat blev gemt til at tjene som indgangsprøve til RT-qPCR. Immunudfældning blev udført ved hjælp af RNA-bindende proteinimmunudfældningssæt (EMD Millipore) baseret på den tidligere rapport ved hjælp af PKR45. Phospho-PKR-antistof (Santa Cruz Biotechnology, sc-101784) eller kontrolkanin-IgG blev anvendt til RNA-IP. RNA blev ekstraheret med TRIzol, efterfulgt af DNase-behandling og ethanoludfældning. cDNA’er blev genereret ved hjælp af tilfældige hexamer-primere og SuperScript Reverse transcriptase II. Prøverne blev analyseret ved PCR (RT) eller qRT-PCR ved hjælp af Power SYBR Green PCR master mix (ThermoFisher). Berigelsen blev beregnet som et forhold (IPprøve pr. indgangsprøve). Primerpar er anført i supplerende tabel 1. Der blev ikke påvist noget SYBR-signal i de negative kontroller, mock-behandlede celler med phospho-PKR-antistof IP og interferon-α + calyculin A-behandlede celler med kontrolkanin IgG IP
PKR-proteinekspression og oprensning
Rekombinant PKR blev oprenset som tidligere rapporteret46. PKR pPET-PKR/PPase (Addgene #42934) blev transformeret i BL21(DE3) Rosetta-celler (Novagen). Cellerne blev dyrket i LB-medium ved 37 °C, indtil A600 nm ~ 0,7, og proteinekspression blev induceret med 1 mM IPTG i 3 timer ved ~20 °C. Til PKR-oprensning blev cellerne resuspenderet i buffer A (20 mM HEPES (pH 7,5), 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 10 mM β-mercaptoethanol, 10 % glycerol) suppleret med proteaseinhibitorcocktail (Sigma). Cellerne blev lyseret ved inkubation med 5 mg pr. ml lysozym i 30 minutter efterfulgt af sonicering i 3 minutter. Lysatet blev centrifugeret i 20 min. ved 20 000 g. Supernatanten blev påført en heparin-sefarosekolonne (Amersham, Biosciences, Piscataway, NJ), der var afbalanceret i buffer A, og PKR blev elueret ved hjælp af en NaCl-gradient. Topfraktionerne blev fortyndet to gange med buffer A og påført en poly(I:C) agarosekolonne (Amersham), der var afbalanceret i buffer A. PKR blev elueret ved 1,1 M NaCl, koncentreret til ~10 mg pr. ml og opbevaret ved -80 °C.
PKR-aktiveringsassay
PKR-aktiveringsassays blev udført som tidligere rapporteret47. PKR blev defosforyleret med λ-proteinphosphatase i 1 time ved 30 °C og derefter inhiberet med 2 mM natriumorthovanadat. PKR (4 μM) blev inkuberet med langt RNA (NM_001136540.1, 289-1453: 0,75 μM: 269 ng pr. ml)/kort RNA (NM_001136540.1, 289-559/560-860/861-1179/1180-1453: 0.1 μM: 8,46 ng pr. ml)/poly (I:C) 20 μg pr. ml, 20 mM HEPES (pH 7,5), 4 mM MgCl2, 50 mM KCl, 1,5 mM DTT og 100 μM ATP (Ambion). Reaktionsblandingerne blev inkuberet ved 30 °C i de angivne tidsrum og slukket med 1× SDS-ladebuffer. Fosforylerede PKR’er blev påvist med phospho-PKR-antistof (Santa Cruz Biotechnology, sc-101784).
RNA-præparering til gelmigrationseksperimenter og SHAPE
Truncated APOL1 RNA’er med forskellige 3′-strukturkassetter blev fremstillet ved in vitro-transskription ved hjælp af MegaShortScript-kittet (ThermoFisher) i henhold til producenternes anbefalinger. Transkriptionsskabeloner blev genereret i to semi-nested PCR-reaktioner fra plasmider, der indeholder APOL1-alleler (G0, G1, G2) eller mutantvarianter heraf (mG0, mG1, mG2). I den første reaktion blev der anvendt fremadrettede og omvendte primere til at tilføje henholdsvis en 5′ T7-promotor og en 45 nt 3′ SC til de afkortede APOL1-sekvenser (Supplerende tabel 1). Sidstnævnte element er indført for at give et hybridiseringssted for omvendt transkription til SHAPE. En fraktion af hver reaktion blev re-amplificeret ved hjælp af den oprindelige fremadrettede primer og en kortere omvendt primer for at gøre de endelige transkriptionsskabeloner mere homogene. Transkriptionsreaktionerne blev behandlet med Turbo DNase I i 5 min. ved 37 °C, inkuberet ved 85 °C i 2 min. og fraktioneret over en denaturerende gel (5 % polyacrylamid-19:1, 1× TBE, 7 M urea) ved konstant temperatur (45 °C, 30 W max.). De ønskede RNA-produkter blev påvist ved UV-skygning, skåret ud af gelen, elektrolyseret ved 200 V i 2 timer ved 4 °C, ethanoludfældet og opbevaret ved -20 °C i 10 mM Tris, pH 7,0 før brug. RNA-stamopløsninger blev kvantificeret ved spektrofotometri.
Gelmigrationsassay
Hvert trunkeret APOL1 RNA blev fortyndet til 1 μM i 20 μL RNA-renatureringsbuffer (RB; 10 mM Tris (pH 8.0), 100 mM KCl, 0,1 mM EDTA, 5 % glycerol (w per v)), denatureret ved opvarmning til 85 °C i 2 min og renatureret ved langsom afkøling (0,1 °C pr. s) til 25 °C. MgCl2 blev derefter tilsat til en slutkoncentration på 0, 1 eller 3 mM, og blandingerne blev inkuberet yderligere 30 min. ved 37 °C for at fremme dannelsen af Mg-afhængige og/eller andre tertiære RNA-interaktioner. RNA-konformerne blev stabiliseret ved lynkøling til 4 °C, hvorefter de blev fraktioneret over en 5% ikke-denaturerende polyakrylamidgel (5% akrylamid, 19:1) i 16-18 timer ved 4 °C. Både gel- og kørselsbuffer indeholdt 1× TBE og 1 mM MgCl2, og gelerne blev forløbet i ~ 1 time før indlæsning. Gelerne blev eksponeret for SybrGreen-farvestof (ThermoFisher) i overensstemmelse med producentens anvisninger, og RNA-konformeres migrationspositioner blev detekteret ved hjælp af en Typhoon Trio+ variable mode imager (GE Healthcare).
SHAPE og generering af sekundære strukturmodeller for RNA
SHAPE-eksperimentelle metoder er tidligere beskrevet48,49. Kort fortalt blev det trunkerede APOL1 RNA med et SC RNA’er foldet som i gelmigrationsassayet, bortset fra at blandingsvolumenet var 150 μL, den endelige MgCl2-koncentration var 1 mM, og glycerol blev udelukket. RNA-opløsninger blev opdelt i kontrol- (1M7-) og eksperimentelle (1M7+) alikvotter (72 μL hver), og der blev tilsat henholdsvis 8 μL DMSO eller 8 μL 30 mM 1M7 i DMSO. Modifikationsreaktionerne blev inkuberet ved 37 °C i 5 minutter, afkølet til 4 °C, udfældet med ethanol og re-suspenderet i 10 μL nucleasefrit vand. Behandlet RNA blev omvendt transskriberet fra forskelligt mærkede primere, der er komplementære til 3′-strukturkassetten (1M7- primer, Cy5,5; 1M7+ primer, Cy5) og hydrolyseret ved alkalibehandling. De resulterende cDNA-biblioteker blev udfældet med ethanol og genopløst i Sample Loading Solution (Genome Lab), hvorefter de blev sammenlagt med ddA- og ddG-sekventeringsstiger mærket med henholdsvis WellRED D2 (Beckman Coulter) og IRDye 800RS (LI-COR). De kombinerede prøver blev fraktioneret ved kapillarelektroforese (CE) ved hjælp af en Beckman Coulter CEQ 8000 Genetic Analyzer. For hvert RNA blev reaktivitetsprofiler genereret fra CE-elektroferogrammer ved hjælp af SHAPEfinder-software50 og derefter indtastet i RNAstructure-software version 5.751,52 sammen med RNA-sekvenserne for at generere sekundære strukturmodeller. Standardparametre for hældning (1,8 kcal pr. mol) og intercept (-0,6 kcal pr. mol) blev anvendt til at omdanne reaktivitetsværdier til pseudoenergibegrænsninger, der modulerer RNA-foldningsalgoritmen. RNAstructure genererer automatisk flere strukturelle modeller, der passer bedst til de SHAPE-afledte reaktivitetsprofiler, og rangordner dem efter Gibbs fri energi. De strukturelle modeller med den laveste energi, der er fremstillet på denne måde, er illustreret i fig. 3a og b samt i supplerende fig. 4.
In vitro knock down
Vi udførte knock down-forsøg ved hjælp af betinget udødeliggjorte humane cellelinjer, der er etableret fra human urin42. Vi transfekterede disse celler med enten Stealth RNAi Negative Control Med GC (ThermoFisher) eller med forud designet stealth siRNA mod APOL1 (HSS112492, ThermoFisher) ved hjælp af Lipofectamine RNAiMAX (ThermoFisher). BLOCK-iT™ Alexa Fluor Red Fluorescent Oligo blev co-transficeret og anvendt som transfektionskontrol. Knock down-effektiviteten var 52,4-75,4 % (RNA-niveauer) eller 31,1 % (proteinniveauer).
Mus
Vi anvendte humane APOL1-genlokus transgene mus (BAC-APOL1-mus), genereret ved hjælp af et bakterielt kunstigt kromosom, der indeholder lokus for APLOL-G0 eller APOL1-G1 eller APOL1-G2. Et humant DNA på ~47 kb, der kun omfatter APOL1-genet med 5′- og 3′-flankerende regioner (herunder exon 1 og 2 af APOL2 og 3′-regionen, herunder exon 39-41 af en del af MYH9-genet), blev isoleret og subklonet fra en human BAC-klon (ENST00000000397278, som svarer til NM_003661). Individuelle G0-, G1- og G2-BAC-subkloner blev injiceret i 129SvJ/B6N F1-embryoner, og grundlæggerne blev efterfølgende krydset tilbage til 129SvJ. Subklonen blev sekventeret for at sikre, at den var som referencegenomsekvens fra NCBI og Ensembl. De eneste forskelle var polymorphismer i de introniske regioner. I de konditionelle transgene museksperimenter anvendte vi podocytspecifikke podocytspecifikke APOL1-trunkerede RNA-transgene mus med FVB-baggrund. Vi producerede disse mus ved hjælp af et betinget transgen system ved hjælp af en nephrin (NPHS1)-promotor-drevet trunkeret RNA-sekvens (NM_001136540, 1031-1453). Vi genererede to stammer: NPHS1-APOL1-G0-delta-RNA med rs73885319 A og rs60910145 G og NPHS1-APOL1-G1-delta-RNA med rs73885319 G og rs60910145 G.
Isolering af glomeruli
BAC/APOL1-mus (mellem 8 og 12 uger gamle) fik indgivet IFNγ (106 U pr. kg kropsvægt IP) dagligt i 3 dage før vævsprøvetagning. Protokollen for den glomerulære isolering er blevet rapporteret i detaljer53. Kort fortalt blev musene bedøvet ved en intraperitoneal injektion af Avertin (2,2,2,2-tribromoethyl- og tertiær amylalkohol; 17 μL pr. g) og perfunderet med 8 × 107 Dynabeads (M450 tosylactiveret: Dynal #140.04) fortyndet i 20 ml fosfatbufferet saltvand gennem hjertet. Nyrerne blev fordøjet med collagenase A og DNase I ved 37 °C i 10 minutter. Det kollagenaseopløste væv blev forsigtigt presset gennem en 100-μm cellefilter og skyllet med HBSS. Prøverne blev vasket og resuspenderet ved hjælp af et magnetisk stativ. Glomeruli blev opsamlet og inkuberet i RPMI1640 suppleret med 10 % FBS, ITS, 1 % penicillin/streptomycin (100 iU pr. ml; 100 μg pr. ml) og 100 mM calyculin A (LC Laboratories) i 30 min og anvendt til Western Blot-analyse.
Immunohistokemi (musekprøver)
BAC/APOL1-mus (mellem 8 og 12 uger gamle) fik indgivet IFNγ (106 U pr. kg kropsvægt IP) dagligt i 3 dage. Musene perfunderes med 100 mM calyculin A indeholdt PBS før vævsprøvetagning. Derefter blev nyrerne skåret i små stykker og inkuberet i RPMI1640 suppleret med 10 % FBS, ITS og 100 mM calyculin A i 30 min. Derefter blev vævene straks fikseret med 10 % buffered formalin. BAC/APOL1-mus (mellem 8 og 12 uger gamle) fik indgivet IFNγ (106 U pr. kg kropsvægt IP) dagligt i 3 dage. NPHS1-APOL1-ΔRNA-mus blev indgivet IFNγ (106 U pr. kg kropsvægt IP) dagligt i 3 dage før vævsprøvetagning. Vi anvendte paraffinfikserede 4-5 μm vævsafsnit. Sektionerne blev deparaffiniseret/rehydreret, og der blev foretaget antigenudtagning ved opvarmning i citratbufferet medium i 5 minutter i en mikrobølgeovn. Vævene blev blokeret med 1 % BSA og 0,1 % saponin. Sektionerne blev inkuberet med primære antistoffer, herunder følgende: APOL1 (Sigma Aldrich HPA018885), phospho-PKR (Santa Cruz Biotechnology sc-1656565), phospho-PKR (Santa Cruz Biotechnology Inc. sc-101784), WT1 (Santa Cruz Biotechnology sc-192) og podocalyxin (R&D Systems AF1556). Til immunofluorescens anvendte vi sekundære Alexa Fluor-antistoffer (ThermoFisher) og visualiserede ved hjælp af konfokal mikroskopi. Til ABC-farvning blev der anvendt biotinkonjugeret sekundært antistof og Avidin-HRP (Vector). Der blev anvendt et DAB-kit (Vector) til visualisering. I museksperimenter blev mus (mellem 8 og 12 uger gamle) behandlet med IFNγ (106 U pr. kg kropsvægt IP), injiceret i 3 dage før vævsprøvetagning. Til signalkvantificering blev phospho-PKR-signalet fra podocytter påvist ved modfarvning for WT1 i museeksperimenter.
Immunohistokemi (humane prøver)
Denne undersøgelse blev på forhånd godkendt af IRB i University of Maryland og af NIDDK, NIH. Grundlæggende karakteristika for tilfældene er anført i supplerende fig. 5b. Farvning blev udført ved hjælp af 5 μm tykke formalinfikserede, paraffinindlejrede vævsafsnit. Efter deparaffinering blev der udført varmeinduceret antigenretrieval i 20 min. i en buffer med pH 6,0 ved hjælp af en trykkoger (Pascal, Agilent Technologies Dako). Sektionerne blev inkuberet med primære antistoffer, herunder følgende: phospho-PKR (Santa Cruz Biotechnology sc-16565) og WT-1 (Santa Cruz Biotechnology sc-192). Vi brugte Alexa Fluor sekundære antistoffer (ThermoFisher) og visualiserede ved hjælp af konfokal mikroskopi.
Immunohistokemi og levende celleafbildning
Celler blev inkuberet med 200 nM Mito Tracker Green (Invitrogen) og 200 nM TMRE (Invitrogen) i 20 min før signaldetektion, efter 20 μM FCCP-behandling og visualiseret ved hjælp af konfokal mikroskopi.
Signalkvantificering af mikroskopiske billeder
For humant væv talte vi glomeruli uden global sklerose (6 tilfælde uden risikogenerotype: 5, 6, 6, 7, 10, 5 og 9 glomeruli for hvert tilfælde, henholdsvis; 6 tilfælde med risikogenotype: henholdsvis 13, 6, 4, 5, 5, 10 og 5 glomeruli). For væv fra mus og mennesker blev lasereffekten justeret således, at det maksimale signal ikke blev mættet. Billedbehandling og kolokaliseringsanalyser blev udført ved hjælp af Zen-softwaren (Carl Zeiss, Oberkochen, Tyskland)54. Vægtet kolokaliseringskoefficient og middelintensitet i WT-1-positive celler blev beregnet som tidligere rapporteret54. For den gennemsnitlige intensitet standardiserede vi podocytsignalintensiteten ved hjælp af signaler fra WT1-negative intra-glomerulære celler for hver glomerulus. Værdierne var relative score med signalintensiteten for APOL1-G0 som 100 %. Kvantificeringer blev udført på en blindet måde.
In situ-hybridisering
Kromogen in situ-detektion blev udført på vævsafsnit fra formalinfikserede paraffinindlejrede (FFPE) blokke af musen ved hjælp af RNAscope in situ-hybridisering (Advanced Cell Diagnostics, Biotechne, Minneapolis, MN). Kort fortalt blev FFPE-vævsafsnit på 5 μm afparaffineret, kogt med forbehandlingsreagens i 15 minutter og derefter proteasefordøjet ved 40 °C i 30 minutter, efterfulgt af hybridisering i 2 timer ved 40 °C med probe-Hs-APOL1-01 (katalog nr. 439871, Advanced Cell Diagnostics). Desuden blev Probe-Mm-PPIB (katalog nr. 313911) og Probe-DapB (katalog nr. 310043) anvendt som henholdsvis positiv og negativ kontrol. Detektion af specifikke sondebindingssteder blev visualiseret med RNAScope 2.0 HD Reagent Kit (Brown) (Catalog # 310035).
Mus proteinuriemodel
Alle eksperimenter blev udført i overensstemmelse med National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals og blev på forhånd godkendt af NIDDK Animal Care and Use Committee (Animal study proposal (K097-KDB-14)). Vi anvendte både han- og hunmus i alderen 8-15 uger. Musene i hvert forsøg blev matchet med hensyn til køn, alder og kropsvægt. Der blev foretaget randomiseringer med hensyn til kropsvægt. Prøvestørrelser for eksperimenter blev bestemt uden formelle effektberegninger. Udelukkelseskriterier var vægttab på mere end 20 % i løbet af forsøgsperioden. Til induktion af proteinuri blev mus (mellem 8 og 12 uger gamle) injiceret med bFGF og puromycin-aminonukleosid som tidligere beskrevet30. For NPHS1-APOL1-deltaRNA-musestammen blev puromycinaminonukleosid (Sigma-Aldrich) injiceret subkutant på dag 0 (200 mg pr. kg kropsvægt), og bFGF (Kaken Pharmaceutical) blev injiceret intravenøst på henholdsvis dag 0 og 2 (5 μg pr. dyr). Til PKR-hæmmerforsøg blev PKR-hæmmer C16 (10 μg pr. kg IP) dagligt fra dag 0 til dag 1055. For BAC-APOL1-musestammen blev interferon γ (Prospec) injiceret på dag -1 og dag 1 (106 U pr. kg kropsvægt), puromycin aminonukleosid blev injiceret subkutant på dag 0 (300 mg pr. kg kropsvægt), og bFGF (Kaken Pharmaceutical) blev injiceret intravenøst på henholdsvis dag 0 og 2 (5 μg pr. dyr). Til PKR-hæmmerforsøg blev PKR-hæmmer C16 (10 μg pr. kg IP) anvendt dagligt fra dag 0 til dag 1055.
Urinær albumin- og kreatininmåling
Vi bestemte urinalbuminniveauerne med ELISA ved hjælp af et murin mikroalbuminuria ELISA-kit (Exocell). Vi målte urinkreatininkoncentrationen med et kreatininkit (Exocell). Alle målinger blev udført i to eksemplarer. Vi bestemte albuminurien som forholdet mellem urinalbumin og kreatinin. Alle procedurer blev udført i overensstemmelse med producenternes protokoller. Investigatorerne var ikke blindet for gruppeallokering, men var blindet ved vurdering af resultatet.
Statistisk analyse
Data fra mindst tre individuelle eksperimenter blev analyseret og præsenteret som dot plot og gennemsnit. Statistiske analysemetoder blev skrevet i hver enkelt figurlegende. Vi justerede ikke for flere sammenligninger. Værdier på P < 0.05 blev betragtet som statistisk signifikante.