Culture cellulaire
Les cellules de rein embryonnaire humain 293FT (HEK293) ont été cultivées dans du DMEM complété par 10% de FBS et 1% de pénicilline/streptomycine (100 iU par ml ; 100 μg par ml). Les lignées cellulaires n’ont pas été authentifiées. Les cellules étaient exemptes de mycoplasmes. Les cellules ont été incubées dans une atmosphère humidifiée à 5 % de CO2 à 37 °C. Pour les lignées cellulaires stables, les cellules transfectées ont été sélectionnées en présence de puromycine (3 μg par ml). Pour les études de transfection transitoire, les cellules HEK293 ont été ensemencées dans des plaques à 6 puits en présence des vecteurs à l’aide de Lipofectamin2000 (ThermoFisher). Des lignées de cellules podocytaires ont été établies à partir d’urine humaine42 et le génotypage d’APOL1 a été réalisé, après obtention du consentement éclairé dans le cadre de protocoles de recherche (94-DK-0127, 94-DK-0133) approuvés au préalable par le NIDDK Institutional Review Board. Le cas A est un homme G0/G0 atteint de FSGS, le cas B est un homme G0/G0 atteint de FSGS associé au VIH, le cas C est un homme G0/G0 atteint de FSGS (HP55-345O-1), le cas D est un homme G1/G2 atteint de FSGS et le cas E est un homme G1/G2 atteint de FSGS associé au VIH. Les cellules ont été cultivées dans du RPMI1640 complété par 10% de FBS, ITS, et 1% de pénicilline/streptomycine (100 iU par ml ; 100 μg par ml). Les cellules ont été incubées dans une atmosphère humidifiée à 5 % de CO2 à 33 °C et différenciées à 37 °C pendant 7 à 10 jours. Les lignées cellulaires n’ont pas été authentifiées. Les cellules étaient exemptes de mycoplasmes. Avant de recueillir les lysats cellulaires, les cellules ont été traitées avec 103 U par ml d’IFNα (Abcam) pendant 24-72 h et 100 mM de calyculine A (LC Laboratories) pendant 30 min. Pour les expériences d’inhibition de la PKR, les cellules ont été traitées avec 1 μM d’inhibiteur imidazolo-oxindole de la PKR C16 (Sigma Aldrich) pendant 1 h43.
Tissus humain
Les tissus de biopsie rénale humaine désidentifiés ont été obtenus auprès du Dr Preeti Chandra, Université du Maryland. La recherche a été approuvée au préalable par les comités d’examen institutionnels de l’Université du Maryland et du NIDDK, NIH.
Informations sur les plasmides
Le vecteur d’expression APOL1 G0 consiste en un ADNc humain APOL1 dérivé du promoteur CMV (NM_001136540 : 298-1453). Pour APOL1 G1 (rs73885319 A→G et/ou rs60910145 T→G) et G2 (rs71785313 del), une mutagenèse dirigée vers le site a été réalisée pour le fabriquer. Pour le vecteur d’expression APOL1 dépourvu d’expression protéique a été produit en insérant un codon stop et une séquence de décalage de cadre (TAATAGATGA) après le 138ème codon. Pour le vecteur de mutation de la structure secondaire, les séquences originales sont modifiées par huit changements synonymes (NM_001136540 : 1195A→T, 1196G→C, 1197C→G, 1203A→T, 1209G→A, 1221G→A, 1224C→G, et 1242T→C). Pour le vecteur dsRNA G0 stable, les séquences originales sont altérées par 5 mutations dans le 3′ UTR (CCA CAG GGC AGG GCA GCC ACC AGG AGA GAT ATG CCT GGC AGG GGC CAG G→CCA CAG GGC AGG CCA GCC ACC AAG AAA GAT ATG CTT GAC AGG GGC CAG G). Pour l’ARN flanquant autour des allèles APOL1 (NM_001136540.1, 1031-1453), pRNAT-CMV3.2/Puro (GeneScript) a été utilisé comme vecteur de fond. Les schémas des cartes vectorielles sont dans la figure supplémentaire 1.
Immunoblotting
Les cellules ont été lysées dans un tampon RIPA contenant un cocktail d’inhibiteurs de protéases/phosphatases. Les lysats ont été séparés par électrophorèse sur gel de SDS-polyacrylamide et les protéines soumises à un western blotting et bloquées pendant 30 min dans le tampon bloquant Odyssey (LI-COR). Les transferts ont été incubés avec des anticorps primaires contre APOL1 (Sigma Aldrich HPA018885), phospho-eIF2α (Cell Signaling Technology #9721), eIF2α (Cell Signaling Technology #5324), β-Actin (Santa Cruz Biotechnology Inc. sc-47778), HRI (Upstate #07-728), phospho-PKR (Santa Cruz Biotechnology Inc. sc-101784), PKR (abcam ab45427), phospho-PERK (Cell Signaling Technology #3179), PERK (Cell Signaling Technology #5683), phospho-GCN (Abcam ab75836), et GCN (Cell Signaling Technology #3302), LC3 (Abcam ab168803) et p62 (Cell Signaling Technology #5114). Les blots ont été incubés avec un anticorps anti-lapin marqué par un colorant (LI-COR). Tous les blots ont été imagés à l’aide du scanner infrarouge Odyssey (LI-COR). Les images brutes de gel sont présentées dans la figure supplémentaire 13.
PCR transcriptase inverse et PCR quantitative en temps réel
Les cellules ou le rein total ont été récoltés dans le réactif TRIzol et l’ARN total a été isolé. L’ARN total a été traité à la DNase avant la synthèse de l’ADNc avec l’oligo (dT). Une aliquote de 5-μg d’ARN a été utilisée pour la synthèse d’ADNc par la transcriptase inverse Superscript II. Les échantillons ont été analysés par PCR (RT) ou RT-PCR quantitative (qRT-PCR) en utilisant le mélange maître Power SYBR Green PCR (ThermoFisher). L’expression relative dans chaque échantillon a été calculée comme un ratio (gène spécifique des attamoles par β-actine). Les paires d’amorces sont répertoriées dans le tableau supplémentaire 1.
Dossier de synthèse des protéines
Les cellules HEK293 transfectées ou les lignées cellulaires de podocytes humains ont été cultivées dans des plaques à 96 puits et ont été traitées avec 103 U par ml d’IFNα (Abcam) pour la quantification ou une lame de chambre pour la visualisation. Le test de synthèse (Click-iT AHA Alexa Fluor 488 Protein Synthesis HCS Assay, catalogue no. C10289, Invitrogen) a été réalisé selon les instructions du fabricant. La contre-coloration nucléaire a été réalisée avec du Hoechst. Les cellules HEK293 sans vecteur traitées avec 1 μM de puromycine (InvivoGen, San Diego, CA) ont été utilisées comme contrôle négatif pour ce test, le bruit de fond étant fixé à 0 % d’intensité du signal. Les cellules HEK293 avec vecteur APOL1 G0 ont été fixées à 100 % d’intensité du signal.
Viabilité cellulaire
Les tests de viabilité cellulaire ont été réalisés à l’aide de tests ATP. Pour quantifier l’ATP généré par les cellules métaboliquement actives, nous avons utilisé un test de viabilité cellulaire luminescent CellTiter-Glo (Promega) selon les instructions du fabricant. Les cellules ont été cultivées dans des plaques 96 puits stériles en présence de 103 U par ml d’IFNα (Abcam) pendant 72 h, puis 100 μL de réactif CellTiter-Glo ont été ajoutés pour lyser les cellules. Après une incubation de 10 min à température ambiante, la luminescence a été détectée à l’aide d’un luminomètre avec un temps d’intégration de 1 s par puits. Les signaux de luminescence des cellules ont été normalisés par le nombre de cellules.
Dosage de la vitesse de prolifération cellulaire
Des cellules ont été ensemencées à 5,0 × 103 cellules par 150 µL de milieu de culture dans chaque puits d’une plaque à 96 puits et l’inhibiteur PKR C16 a été ajouté à la concentration indiquée. Après 0, 24, 48, 50 µL, le nombre de cellules a été mesuré par le kit de comptage cellulaire-8 (Sigma-Aldrich).
Taux de consommation d’oxygène dans les podocytes humains en culture
L’analyseur de flux extracellulaire XF24 (Seahorse Bioscience, Billerica, MA) a été utilisé pour évaluer les taux de consommation d’oxygène (RCO) cellulaires selon les instructions de la société. Brièvement, des podocytes humains en culture ont été ensemencés dans des plaques à puits XF24 achetées auprès de Seahorse Bioscience, à une densité de 2,0 × 104 cellules par puits (surface de 0,33 cm2) dans 100 μL de milieu de culture et ont été incubés pendant une nuit à 37 °C. Le jour suivant, les cellules ont été traitées avec de l’IFNα (1 × 103 U par ml) avec/sans inhibiteur PKR C16 (100 nM) pendant 72 h, puis 24 h de traitement sur les plaques à puits XF24. Avant les mesures d’OCR, la plaque XF24 expérimentale contenant les cellules a été lavée avec du milieu d’essai DMEM sans bicarbonate (Seahorse Bioscience) contenant 25 mM de glucose et 1 mM de pyruvate de sodium, et les cellules ont été préincubées pendant 1 h à 37 °C sans apport de CO2 dans 625 μL de milieu d’essai. Avant les mesures de l’OCR, le XF24 a été calibré à l’aide d’une cartouche de calibrage selon les instructions de la société. Après l’étalonnage, des mesures de référence de l’OCR ont été effectuées dans la plaque de test pendant 4 min.
Immunoprécipitation d’ARN (RNA-IP)
Les cellules HEK293 stables portant la variante APOL1-G0, G1 ou G2 ont été traitées par simulacre avec les éléments suivants : (a) 103 U par ml d’IFNα pendant 24-72 h et 100 μM d’acide palmitique (Sigma) pendant 2 h, ou (b) 100 mM 103 U par ml d’IFNα pendant 24-72 h et calyculine A pendant 30 min. L’acide palmitique se lie directement à PKR et inhibe la liaison de l’ARNdb à PKR44 ; l’acide palmitique a donc été utilisé comme contrôle négatif. Les cellules ont été irradiées avec une lumière UV à 200 mJ par cm2. Dix pour cent de chaque lysat cellulaire ont été conservés pour servir d’échantillon d’entrée pour la RT-qPCR. L’immunoprécipitation a été réalisée à l’aide du kit d’immunoprécipitation de la protéine de liaison à l’ARN (EMD Millipore) sur la base du rapport précédent utilisant PKR45. L’anticorps Phospho-PKR (Santa Cruz Biotechnology, sc-101784) ou l’IgG de lapin de contrôle a été utilisé pour la RNA-IP. L’ARN a été extrait avec TRIzol, suivi d’un traitement à la DNase et d’une précipitation à l’éthanol. Les ADNc ont été générés en utilisant des amorces hexamères aléatoires et la transcriptase inverse SuperScript II. Les échantillons ont été analysés par PCR (RT) ou qRT-PCR en utilisant le mélange maître Power SYBR Green PCR (ThermoFisher). L’enrichissement a été calculé sous forme de ratio (échantillon IP par échantillon d’entrée). Les paires d’amorces sont énumérées dans le tableau supplémentaire 1. Aucun signal SYBR n’a été détecté dans les contrôles négatifs, les cellules traitées par simulacre avec l’anticorps phospho-PKR IP et les cellules traitées par interféron-α + calyculine A avec l’IgG de lapin contrôle IP
Expression et purification de la protéine PKR
La PKR recombinante a été purifiée comme indiqué précédemment46. PKR pPET-PKR/PPase (Addgene #42934) a été transformé dans des cellules BL21(DE3) Rosetta (Novagen). Les cellules ont été cultivées dans un milieu LB à 37 °C jusqu’à ce que A600 nm ~ 0,7 et l’expression de la protéine a été induite avec 1 mM IPTG pendant 3 h à ~20 °C. Pour la purification de PKR, les cellules ont été remises en suspension dans un tampon A (20 mM HEPES (pH 7,5), 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 10 mM β-mercaptoéthanol, 10% glycérol) complété par un cocktail d’inhibiteurs de protéases (Sigma). Les cellules ont été lysées par incubation avec 5 mg par ml de lysozyme pendant 30 min, suivie d’une sonication pendant 3 min. Le lysat a été centrifugé pendant 20 min à 20 000g. Le surnageant a été appliqué sur une colonne d’héparine Sepharose (Amersham, Biosciences, Piscataway, NJ) équilibrée dans le tampon A et PKR a été élué en utilisant un gradient de NaCl. Les fractions de pic ont été diluées deux fois avec le tampon A et appliquées à une colonne d’agarose poly(I:C) (Amersham) équilibrée dans le tampon A. PKR a été élué à 1,1 M NaCl, concentré à ~10 mg par ml et stocké à -80 °C.
Dosage d’activation de PKR
Les dosages d’activation de PKR ont été réalisés comme précédemment rapporté47. PKR a été déphosphorylé par la λ-protéine phosphatase pendant 1 h à 30 °C, puis inhibé avec de l’orthovanadate de sodium 2 mM. PKR (4 μM) a été incubé avec de l’ARN long (NM_001136540.1, 289-1453 : 0,75 μM : 269 ng par ml)/de l’ARN court (NM_001136540.1, 289-559/560-860/861-1179/1180-1453 : 0.1 μM : 8,46 ng par ml)/poly (I:C) 20 μg par ml, 20 mM HEPES (pH 7,5), 4 mM MgCl2, 50 mM KCl, 1,5 mM DTT et 100 μM ATP (Ambion). Les mélanges réactionnels ont été incubés à 30 °C pendant les durées indiquées et refroidis avec un tampon de chargement SDS 1×. Les PKR phosphorylés ont été détectés avec l’anticorps phospho-PKR (Santa Cruz Biotechnology, sc-101784).
Préparation des ARN pour les expériences de migration sur gel et SHAPE
Des ARN APOL1 tronqués avec diverses cassettes de structure 3′ ont été préparés par transcription in vitro à l’aide du kit MegaShortScript (ThermoFisher) selon les recommandations des fabricants. Les modèles de transcription ont été générés dans deux réactions PCR semi-nichées à partir de plasmides contenant les allèles APOL1 (G0, G1, G2) ou leurs variants mutants (mG0, mG1, mG2). Pour la première réaction, des amorces directes et inverses ont été utilisées pour ajouter un promoteur T7 5′ et un SC 3′ de 45 nt, respectivement, aux séquences APOL1 tronquées (tableau supplémentaire 1). Ce dernier élément est introduit pour fournir un site d’hybridation de transcription inverse pour SHAPE. Une fraction de chaque réaction a été réamplifiée en utilisant l’amorce avant originale et une amorce inverse plus courte pour rendre les modèles de transcription finaux plus homogènes. Les réactions de transcription ont été traitées avec de la Turbo DNase I pendant 5 minutes à 37 °C, incubées à 85 °C pendant 2 minutes et fractionnées sur un gel dénaturant (5 % polyacrylamide-19:1, 1× TBE, urée 7 M) à température constante (45 °C, 30 W max). Les produits ARN souhaités ont été détectés par ombrage UV, excisés du gel, électrolysés à 200 V pendant 2 h à 4 °C, précipités à l’éthanol et stockés à -20 °C dans du Tris 10 mM, pH 7,0 avant utilisation. Les solutions d’ARN stock ont été quantifiées par spectrophotométrie.
Essai de migration sur gel
Chaque ARN APOL1 tronqué a été dilué à 1 μM dans 20 μL de tampon de renaturation d’ARN (RB ; 10 mM Tris (pH 8.0), 100 mM KCl, 0,1 mM EDTA, 5 % de glycérol (p/v)), dénaturé par chauffage à 85 °C pendant 2 min et renaturé par refroidissement lent (0,1 °C par s) à 25 °C. Du MgCl2 a ensuite été ajouté à une concentration finale de 0, 1 ou 3 mM et les mélanges ont été incubés pendant 30 minutes supplémentaires à 37 °C pour favoriser la formation d’interactions ARN dépendantes du Mg et/ou d’autres interactions ARN tertiaires. Les conformères d’ARN ont été stabilisés par un refroidissement rapide à 4 °C, après quoi ils ont été fractionnés sur un gel de polyacrylamide non dénaturant à 5 % (acrylamide à 5 %, 19:1) pendant 16 à 18 heures à 4 °C. Le gel et le tampon d’exécution contenaient 1× TBE et 1 mM MgCl2, et les gels ont été exécutés pendant environ 1 heure avant le chargement. Les gels ont été exposés au colorant SybrGreen (ThermoFisher) conformément aux instructions du fabricant et les positions de migration des conformères d’ARN ont été détectées à l’aide d’un imageur à mode variable Typhoon Trio+ (GE Healthcare).
SHAPE et génération de modèles structurels secondaires d’ARN
Les méthodes expérimentalesSHAPE ont été décrites précédemment48,49. Brièvement, l’ARN APOL1 tronqué avec un SC ARN ont été pliés comme dans l’essai de migration sur gel, sauf que le volume du mélange était de 150 μL, la concentration finale de MgCl2 était de 1 mM et le glycérol était exclu. Les solutions d’ARN ont été divisées en aliquotes de contrôle (1M7-) et expérimentales (1M7+) (72 μL chacune), et 8 μL de DMSO ou 8 μL de 30 mM de 1M7 dans du DMSO ont été ajoutés, respectivement. Les réactions de modification ont été incubées à 37 °C pendant 5 min, refroidies à 4 °C, précipitées à l’éthanol et remises en suspension dans 10 μL d’eau exempte de nucléase. Les ARN traités ont été transcrits de manière inverse à partir d’amorces marquées différemment et complémentaires de la cassette de structure 3′ (amorce 1M7-, Cy5,5 ; amorce 1M7+, Cy5) et hydrolysés par traitement alcalin. Les bibliothèques d’ADNc résultantes ont été précipitées avec de l’éthanol et redissoutes dans la solution de chargement d’échantillons (Genome Lab), puis regroupées avec des échelles de séquençage ddA et ddG marquées avec WellRED D2 (Beckman Coulter) et IRDye 800RS (LI-COR), respectivement. Les échantillons combinés ont été fractionnés par électrophorèse capillaire (EC) à l’aide d’un analyseur génétique CEQ 8000 de Beckman Coulter. Pour chaque ARN, des profils de réactivité ont été générés à partir des électrophérogrammes d’EC à l’aide du logiciel SHAPEfinder50, puis saisis dans le logiciel RNAstructure version 5.751,52 avec les séquences d’ARN pour générer des modèles de structure secondaire. Les paramètres de pente (1,8 kcal par mole) et d’interception (-0,6 kcal par mole) par défaut ont été utilisés pour transformer les valeurs de réactivité en contraintes de pseudo-énergie qui modulent l’algorithme de repliement de l’ARN. RNAstructure génère automatiquement plusieurs modèles structurels qui correspondent le mieux aux profils de réactivité dérivés de SHAPE et les classe par énergie libre de Gibbs. Les modèles structuraux les moins énergiques produits de cette manière sont illustrés dans les Fig. 3a, b et dans la Fig. 4 supplémentaire.
Cock down in vitro
Nous avons mené des expériences de knock down en utilisant des lignées cellulaires humaines immortalisées conditionnellement établies à partir d’urine humaine42. Nous avons transfecté ces cellules avec le contrôle négatif Stealth RNAi Med GC (ThermoFisher) ou avec le siRNA stealth prédéfini contre APOL1 (HSS112492, ThermoFisher) en utilisant Lipofectamine RNAiMAX (ThermoFisher). BLOCK-iT™ Alexa Fluor Red Fluorescent Oligo a été co-transfecté et utilisé comme contrôle de transfection. Les efficacités de knock down étaient de 52,4 à 75,4 % (niveaux d’ARN) ou 31,1 % (niveaux de protéines).
Souris
Nous avons utilisé des souris transgéniques du locus du gène humain APOL1 (souris BAC-APOL1), générées à l’aide d’un chromosome artificiel bactérien qui contient le locus pour APLOL-G0, ou APOL1-G1, ou APOL1-G2. Un ADN humain de ~47 kb, englobant uniquement le gène APOL1 avec les régions flanquantes 5′ et 3′ (incluant les exons 1 et 2 de APOL2 et la région 3′ incluant les exons 39-41 d’une partie du gène MYH9), a été isolé et sous-cloné à partir d’un clone BAC humain (ENST00000397278, qui correspond à NM_003661). Des sous-clones BAC individuels G0, G1 et G2 ont été injectés dans des embryons F1 129SvJ/B6N et les fondateurs ont ensuite été rétrocroisés en 129SvJ. Le sous-clone a été séquencé pour s’assurer qu’il correspondait à la séquence génomique de référence du NCBI et d’Ensembl. Les seules différences étaient des polymorphismes dans les régions introniques. Dans les expériences de souris transgéniques conditionnelles, nous avons utilisé des souris transgéniques à ARN tronqué APOL1 spécifiques des podocytes, de fond FVB. Nous avons produit ces souris au moyen d’un système transgénique conditionnel utilisant la séquence d’ARN tronqué pilotée par le promoteur de la néphrine (NPHS1) (NM_001136540, 1031-1453). Nous avons généré deux souches : NPHS1-APOL1-G0-delta-ARN avec rs73885319 A et rs60910145 G et NPHS1-APOL1-G1-delta-ARN avec rs73885319 G et rs60910145 G.
Isolation des glomérules
Les souris BAC/APOL1 (âgées de 8 à 12 semaines) ont reçu de l’IFNγ (106 U par kg de poids corporel IP) quotidiennement pendant 3 jours avant le prélèvement des tissus. Le protocole d’isolement glomérulaire a été rapporté en détail53. Brièvement, les souris ont été anesthésiées par une injection intrapéritonéale d’Avertin (2,2,2-tribromoéthyl et alcool amylique tertiaire ; 17 μL par g) et perfusées avec 8 × 107 Dynabeads (M450 tosylactivated : Dynal #140.04) diluées dans 20 ml de solution saline tamponnée au phosphate à travers le cœur. Les reins ont été digérés avec de la collagénase A et de la DNase I à 37 °C pendant 10 minutes. Les tissus digérés par la collagénase ont été délicatement pressés à travers une crépine cellulaire de 100-μm et lavés avec du HBSS. Les échantillons ont été lavés et remis en suspension à l’aide d’un support magnétique. Les glomérules ont été collectés et incubés dans du RPMI1640 complété par 10 % de FBS, ITS, 1 % de pénicilline/streptomycine (100 iU par ml ; 100 μg par ml) et 100 mM de calyculine A (LC Laboratories) pendant 30 min et utilisés pour l’analyse Western blot.
Immunohistochimie (échantillons de souris)
Les souris BAC/APOL1 (âgées de 8 à 12 semaines) ont reçu de l’IFNγ (106 U par kg de poids corporel IP) quotidiennement pendant 3 jours. Les souris sont perfusées avec de la calyculine A 100 mM contenue dans du PBS avant le prélèvement des tissus. Ensuite, les reins ont été coupés en petits morceaux et incubés dans du RPMI1640 complété par 10% de FBS, ITS, et 100 mM de calyculine A pendant 30 min. Les tissus ont ensuite été immédiatement fixés avec du formol tamponné à 10 %. Les souris BAC/APOL1 (âgées de 8 à 12 semaines) ont reçu l’IFNγ (106 U par kg de poids corporel IP) quotidiennement pendant 3 jours. Les souris NPHS1-APOL1-ΔRNA ont reçu de l’IFNγ (106 U par kg de poids corporel IP) quotidiennement pendant 3 jours avant le prélèvement des tissus. Nous avons utilisé des sections de tissu de 4-5 μm fixées en paraffine. Les sections ont été déparaffinées/réhydratées, la récupération d’antigène effectuée par chauffage dans un milieu tamponné au citrate pendant 5 min au micro-ondes. Les tissus ont été bloqués par 1% de BSA et 0,1% de saponine. Les coupes ont été incubées avec des anticorps primaires comprenant les éléments suivants : APOL1 (Sigma Aldrich HPA018885), phospho-PKR (Santa Cruz Biotechnology sc-16565), phospho-PKR (Santa Cruz Biotechnology Inc. sc-101784), WT1 (Santa Cruz Biotechnology sc-192), et podocalyxine (R&D Systems AF1556). Pour l’immunofluorescence, nous avons utilisé des anticorps secondaires Alexa Fluor (ThermoFisher) et visualisé en utilisant la microscopie confocale. Pour la coloration ABC, nous avons utilisé un anticorps secondaire conjugué à de la biotine et de l’Avidin-HRP (Vector). Un kit DAB (Vector) a été utilisé pour la visualisation. Dans les expériences sur les souris, les souris (âgées de 8 à 12 semaines) ont été traitées par IFNγ (106 U par kg de poids corporel IP), injecté pendant 3 jours avant le prélèvement des tissus. Pour la quantification du signal, le signal phospho-PKR du podocyte a été détecté par une contre-coloration pour WT1 dans les expériences sur les souris.
Immunohistochimie (spécimens humains)
Cette étude a été approuvée à l’avance par l’IRB de l’Université du Maryland et du NIDDK, NIH. Les caractéristiques de base des cas sont énumérées dans la figure supplémentaire 5b. La coloration a été réalisée à l’aide de sections de tissu de 5 μm d’épaisseur fixées au formol et incluses en paraffine. Après la déparaffinisation, la récupération d’antigène induite par la chaleur a été réalisée pendant 20 min dans un tampon de pH 6,0 à l’aide d’un autocuiseur (Pascal, Agilent Technologies Dako). Les sections ont été incubées avec les anticorps primaires suivants : phospho-PKR (Santa Cruz Biotechnology sc-16565) et WT-1 (Santa Cruz Biotechnology sc-192). Nous avons utilisé des anticorps secondaires Alexa Fluor (ThermoFisher) et visualisé à l’aide de la microscopie confocale.
Immunohistochimie et imagerie de cellules vivantes
Les cellules ont été incubées avec 200 nM de Mito Tracker Green (Invitrogen) et 200 nM de TMRE (Invitrogen) pendant 20 min avant la détection du signal, après le traitement par FCCP 20 μM et visualisées à l’aide de la microscopie confocale.
Quantification du signal des images microscopiques
Pour les tissus humains, nous avons compté les glomérules sans sclérose globale (6 cas de génotype non à risque : 5, 6, 7, 10, 5, et 9 glomérules pour chaque cas, respectivement ; 6 cas de génotype à risque : 13, 6, 4, 5, 10 et 5 glomérules, respectivement). Pour les tissus de la souris et de l’homme, la puissance du laser a été ajustée de manière à ne pas saturer le signal maximal. Le traitement des images et les analyses de colocalisation ont été effectués à l’aide du logiciel Zen (Carl Zeiss, Oberkochen, Allemagne)54. Le coefficient de colocalisation pondéré et l’intensité moyenne dans les cellules positives WT-1 ont été calculés comme indiqué précédemment54. Pour l’intensité moyenne, nous avons normalisé l’intensité du signal des podocytes en utilisant les signaux des cellules intraglomérulaires WT1-négatives pour chaque glomérule. Les valeurs étaient des scores relatifs, l’intensité du signal d’APOL1-G0 étant de 100 %. Les quantifications ont été réalisées en aveugle.
Hybridation in situ
La détection in situ des chromogènes a été réalisée sur des coupes de tissus provenant des blocs de souris fixés au formol et inclus en paraffine (FFPE) en utilisant l’hybridation in situ RNAscope (Advanced Cell Diagnostics, Biotechne, Minneapolis, MN). Brièvement, des sections de tissu FFPE de 5 μm ont été dé-paraffinées, bouillies avec un réactif de prétraitement pendant 15 min, puis digérées par protéase à 40 °C pendant 30 min, suivies d’une hybridation pendant 2 h à 40 °C avec la sonde-Hs-APOL1-01 (n° de catalogue 439871, Advanced Cell Diagnostics). De plus, la sonde-Mm-PPIB (Catalogue # 313911) et la sonde-DapB (Catalogue # 310043) ont été utilisées comme contrôle positif et négatif, respectivement. La détection des sites de liaison des sondes spécifiques a été visualisée avec le kit de réactifs RNAScope 2.0 HD (brun) (catalogue # 310035).
Modèle de protéinurie de souris
Toutes les expériences ont été menées conformément au guide des Instituts nationaux de la santé pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire et ont été approuvées à l’avance par le comité de soins et d’utilisation des animaux du NIDDK (proposition d’étude sur les animaux (K097-KDB-14)). Nous avons utilisé des souris mâles et femelles, âgées de 8 à 15 semaines. Les souris de chaque expérience étaient appariées pour le sexe, l’âge et le poids corporel. Les randomisations ont été effectuées en fonction du poids corporel. La taille des échantillons pour les expériences a été déterminée sans calcul formel de la puissance. Les critères d’exclusion étaient une perte de poids de plus de 20 % pendant la période expérimentale. Pour l’induction de la protéinurie, les souris (âgées de 8 à 12 semaines) ont reçu une injection de bFGF et de puromycine aminonucléoside, comme décrit précédemment30. Pour la souche de souris NPHS1-APOL1-deltaRNA, la puromycine aminonucléoside (Sigma-Aldrich) a été injectée par voie sous-cutanée au jour 0 (200 mg par kg de poids corporel), et le bFGF (Kaken Pharmaceutical) a été injecté par voie intraveineuse aux jours 0 et 2 (5 μg par animal), respectivement. Pour les expériences sur l’inhibiteur PKR, l’inhibiteur PKR C16 (10 μg par kg IP) a été administré quotidiennement du jour 0 au jour 1055. Pour la souche de souris BAC-APOL1, l’interféron γ (Prospec) a été injecté au jour -1 et au jour 1 (106 U par kg de poids corporel), la puromycine aminonucléoside a été injectée par voie sous-cutanée au jour 0 (300 mg par kg de poids corporel), et le bFGF (Kaken Pharmaceutical) a été injecté par voie intraveineuse aux jours 0 et 2 (5 μg par animal), respectivement. Pour les expériences sur l’inhibiteur PKR, l’inhibiteur PKR C16 (10 μg par kg IP) quotidiennement du jour 0 au jour 1055.
Mesure de l’albumine urinaire et de la créatinine
Nous avons déterminé les niveaux d’albumine urinaire par ELISA en utilisant un kit ELISA de microalbuminurie murine (Exocell). Nous avons mesuré la concentration de créatinine urinaire avec le kit créatinine (Exocell). Toutes les mesures ont été effectuées en double. Nous avons déterminé l’albuminurie comme le rapport entre l’albumine urinaire et la créatinine. Toutes les procédures ont été effectuées en accord avec les protocoles des fabricants. Les investigateurs n’étaient pas aveugles quant à l’allocation des groupes mais l’étaient lors de l’évaluation des résultats.
Analyse statistique
Les données d’au moins trois expériences individuelles ont été analysées et présentées sous forme de graphique en points et de moyenne. Les méthodes d’analyse statistique étaient écrites dans les légendes de chaque figure. Nous n’avons pas ajusté pour les comparaisons multiples. Les valeurs de P < 0,05 ont été considérées comme statistiquement significatives.