2 Livshistorie
FBF-cerkarier er meget små, er vanskelige at identificere morfologisk og har typisk en ekstremt lav prævalens af infektion blandt hvirvelløse mellemværtspopulationer (Cribb et al., 2011). Måske som følge af disse egenskaber er den/de mellemliggende vært(er) ukendt(e) for alle undtagen nogle få FBF-arter: flere arter af ferskvandsslægten Sanguinicola (se Bullard og Overstreet, 2008) og de marine arter Aporocotyle simplex (se Køie, 1982; Køie og Petersen, 1988, eksperimentelle infektioner; ingen anvendte molekylære markører), Paracardicoloides yamagutii (se Nolan og Cribb, 2004a; se efterfølgende tekst), C. forsteri (se Cribb et al, 2011; se efterfølgende tekst), og Cardicola opisthorchis (se Sugihara et al., 2014; se efterfølgende tekst). ITS2 rDNA-sekvenser er blevet anvendt til at matche morfologisk ubestemmelige larveprøver af FBF, dvs. cercariae, sporocyster og rediae, indsamlet fra hvirvelløse værter med morfologisk distinkte voksne prøver fra sympatriske fiskeværter. Molekylære markører gør det muligt hurtigt og billigt at påvise infektioner, at identificere det inficerende agens ved hjælp af fylogenetisk slutning eller ved sekvenshomologi med et allerede sekventeret taxon og at identificere mellemværter, hvorved potentielt patogene FBF’ers livsforløb kan forbindes. Bestemmelse af identiteten af mellemværter og endelige værter er helt sikkert et afgørende første skridt i forståelsen af FBF’s livscyklus. Ud over de diagnostiske metoder er der imidlertid stadig meget at lære om de specifikke detaljer i vært-parasit-forholdet mellem FBF’er og deres mellemliggende værter af polychaeter, snegle og toskallede dyr. Når alt kommer til alt, kan deres udviklingshistorie meget vel være påvirket lige så meget, eller mere, af disse mellemværter som af deres endelige værter. Som sådan argumenterer vi for, at molekylære undersøgelser ikke helt bør erstatte klassiske eksperimentelle undersøgelser, hvor der foretages direkte mikroskopiobservationer af larve- og voksne FBF’er i værtsvæv efter eksponering af naive hvirvelløse og endelige fiskeværter (Køie, 1982).
Meget af informationen om FBF’ers livscyklus stammer fra vanddyrsundhedsprogrammer i forbindelse med kommerciel akvakultur: 17 ud af 109 (16 %) af de tilgængelige FBF-sekvenser i GenBank stammer fra infektioner i marine akvakulturer (tabel 1.1). FBF’er er en af de få trematodegrupper, hvis medlemmer kan skade den endelige fiskevært som voksne fisk, der blokerer blodkar og forårsager asfyksi, som æg, der beskadiger eller blokerer gællesepitel og grenkar, og som miracidier, der klækker fra æg, der er indlejret i gællesepitel og borer sig ud af fisken (Bullard og Overstreet, 2002, 2008). Som sådan er deres livscyklus et problem for kommercielle akvakulturer, fordi FBF’er kan dræbe eller svække fisk og forårsage økonomiske tab i ferskvandsdamme, løbebaner og havbure til havs. Sekvenser fra ikke-voksne FBF’er, der inficerer snegle-, toskallede og polychaete-værter, som huser FBF’s aseksuelle reproduktionsstadier – spirocyster, rediae og cercariae – er langt mindre talrige (4 ud af 109) (tabel 1.1) end sekvenser fra voksne eksemplarer, der inficerer fiskeværter.
I den første offentliggjorte undersøgelse af FBF’s livscyklus bestemt ved anvendelse af en molekylær metode dokumenterede Nolan og Cribb (2004a) to cercariamorfotyper (“type A” og “type B”), der inficerede 80 ud af 11.314 (0,7%) eksemplarer af den hydrobiide snegle Posticobia brazieri i tidevandsbække i Queensland, Australien. ITS2 rDNA-sekvenser fra cercaria type A tilpassede sig (100 % overensstemmelse) med voksne eksemplarer af P. yamagutii, der blev indsamlet fra blodet (dorsal aorta, atrium, ventrikel, gæller, nyre og blodkar i tarmen og svømmeblæren) hos spættet langfinnet ål Anguilla reinhardtii. I en anden undersøgelse, som svarede på bekymringer om sygdomme i forbindelse med infektioner af C. forsteri, der inficerede opdrættet sydlig tun T. maccoyii ud for Sydaustralien, screenede Cribb et al. (2011) 9351 individer fra 11 familier af toskallede, 2 sneglearter og 24 polychaete-familier for FBF-infektioner. ITS2 rDNA-sekvensdata afledt af cerkarier, der inficerede Longicarpus modestus (Polychaeta: Terebellidae), tilpassede sig med 100 % overensstemmelse med voksne eksemplarer af C. forsteri fra hjertet af nærliggende sydlig blåfinnet tun i et netbassin ved Port Lincoln, Australien. De sekventerede også 28S rDNA-fragmentet (721 bp i D1-D2-regionen) fra cercaria af C. forsteri, der inficerede L. modestus. Efter fremgangsmåden fra Cribb et al. (2011) fokuserede Sugihara et al. (2014) på polychaeter, mens de undersøgte 744 hvirvelløse dyr for FBF-infektioner i et kultursted for stillehavsblåfinnet tun Thunnus orientalis ud for det sydlige Japan. Sporocyster og cercaria af FBF’er blev fundet i fem individer af en terebellid polychaete (Terebella), der blev indsamlet fra indersiden af skallen på døde barnefisk, der var taget fra substratet og fra reb og flydere under havburet. ITS2- og 28S-sekvenser fra sporocyster var identiske (100 %) med sekvenserne fra voksne C. opisthorchis fra hjertet af opdrættet stillehavsblåfinnet tun.
Shirakashi et al. (2012) undersøgte samtidige infektioner af Cardicola orientalis og C. opisthorchis i stillehavsblåfinnet tun. De brugte ITS2 rDNA-sekvensdata til at skelne de halvmåneformede æg af C. opisthorchis i den afferente filamentarterie fra de æg af C. orientalis, der inficerer gællelamellerne, fra de æg af C. orientalis, der er æg af ovoide form. De erklærede, at artsspecifikke PCR-primere anvendt på prøver af gællevæv kunne supplere histopatologi og hjælpe med at diagnosticere infektioner, før æggene og de voksne er talrige nok til, at de let kan observeres med lysmikroskopi. Yong et al. (2013) brugte fuldstændige ITS2 rDNA-sekvensdata til at identificere FBF-æggene, der var anbragt i gællerne hos fem arter af sommerfuglefisk (Perciformes: Chaetodontidae) fra Great Barrier Reef, som en enkelt art Cardicola chaetodontis (en enkelt basepars forskel i to prøver). FBF-æg observeres ikke sjældent i gællesepitelet og grenarterioler hos fisk under rutinemæssige fiskesekropsier (SAB, personlige observationer), men i mange tilfælde genfindes de tilsvarende voksne eksemplarer, der inficerer blodet hos den enkelte fisk, ikke. Molekylære teknikker, der effektivt ekstraherer og forstærker DNA fra FBF-æg, som er meget små, f.eks. er æggene af C. chaetodontis 40-60 μm i samlet længde, lover at afsløre tilstedeværelsen af unavngivne FBF-arter og hidtil udokumenterede værter, hvis de resulterende sekvenser sættes i en fylogenetisk sammenhæng med sekvenser fra navngivne arter. Det samme kan siges om sekvenser, der stammer fra cerkarier (se den efterfølgende tekst). Ved hjælp af kvantitativ polymerasekædereaktion (qPCR) identificerede Norte Do Santos et al. (2012) æg af C. forsteri aggregeret i gæller fra opdrættet sydlig almindelig tun. På samme måde anvendte Kirchhoff et al. (2012) denne metode til at diagnosticere æg af C. forsteri, der inficerer T. maccoyii. Polinski et al. (2013) tog metoden et skridt videre ved at udvikle en følsom og præcis realtids-PCR-teknik, der også kan anvendes til identifikation af C. forsteri, C. orientalis og C. opisthorchis i ikke-dødbringende prøver. Der blev ikke påvist nogen forstærkning på tværs af arter eller værtsgenomisk amplifikation i nogen af de testede metoder, dvs. SYBR-baseret qPCR og en fælles reporter TaqMan-assay; deres kombinerede anvendelse forbedrede imidlertid pålideligheden med hensyn til at skelne arter. Disse metoder har bekræftet samtidige infektioner af C. forsteri og C. orientalis i T. maccoyii, hvilket også indikerer den højere prævalens og udbredelse af C. orientalis i værten.
Den nylige anvendelse af begge udviklede teknikker blev støttet til at vurdere de patologiske konsekvenser af FBF-infektioner. Polinski et al. (2014) kombinerede qPCR med immuntransskription af værtsgenet til at kvantificere mængden af DNA fra væv, der er inficeret af C. opisthorchis og C. orientalis. De kvantificerede også det temporale værtsimmunrespons på disse infektioner i burhuggede stillehavsblåfinnet tun. Tidligere data dokumenterede voksne og æg af C. orientalis i gællerne (Ogawa et al., 2010; Shirakashi et al., 2012), mens voksne og æg af C. opisthorchis inficerede henholdsvis hjertet og de afferente grenarterier (Ogawa et al., 2011; Shirakashi et al., 2012). Polinski et al. (2014) resultater afslørede imidlertid en korrelation af IgM-transkription til de store mængder af “kun C. orientalis”-infektioner i gællevævet, men ikke til DNA af C. opisthorchis, hvilket tyder på, at et sådant immunrespons i dette organ kan blive udløst af tilstedeværelsen af voksne snarere end af æg. Desuden blev høje niveauer af DNA af C. orientalis i hjertet tilskrevet tilstedeværelsen af juvenile flukes. Selv om sådanne metoder ikke kan identificere FBF’s livsstadier, eller om flukes er levende eller døde, giver denne kvantitative tilgang mulighed for at gisne om infektionsintensitet og infektionsstatus, hvilket i sig selv er et lovende redskab til fremtidige epidemiologiske undersøgelser, der omfatter vilde eller opdrættede fisk.
Brant et al. (2006) anvendte fylogenetisk inferens (28S, 18S og COI) ved behandling af flere uidentificerede formodede FBF-cerkarier, der var isoleret fra snegle (Planorbidae og Thiaridae) i Uganda, Kenya og Australien. De karakteriserede cerkarierne morfologisk ved hjælp af fotomikrografer og på grundlag af tilstedeværelsen/fraværet af øjenpletter, finnefolder på cerkariehale og krop samt haleform. Selv om der mangler en konsistent og fylogenetisk sammenhængende, morfologisk baseret definition (diagnose) af FBF-cerkarier, er disse cerkarier typisk karakteristiske: meget små, gaffelhalede, uden ventral sugekop, med et karakteristisk penetrerende organ, der sandsynligvis består af en specialiseret forreste sugekop (Truong og Bullard, 2013), en finnefold på cerkariekroppen og en finnefold til stede eller fraværende på halefurkaerne (Cribb et al., 2011). En af disse cerkarier (W5004) var særligt morfologisk bizar, dvs. beskrevet som apharyngeat og furcocercus, men med “ekstravagante laterale halemembraner og en spids kropsform”, og ingen af disse cerkarier havde alle de typiske træk ved FBF-cerkarier (se forrige tekst). Den kombinerede 18S- og 28S-analyse af disse cercariae grupperede dem imidlertid sammen med andre FBF-sekvenser (vi formoder, at “Sanguinicolid sp.” er den af “Sanguinicola cf. inermis” (AY222180)). Af denne grund og fordi de morfologisk set var bizarre i forhold til kendte FBF-cerkarier, antog disse forfattere, at der findes en langt større morfologisk diversitet af FBF-cerkarier, end der hidtil er blevet anerkendt i litteraturen. Den taksonomiske identitet og fylogenetiske betydning af disse sekvenser diskuteres yderligere senere i teksten.