2 Life History
FBF cercariae sunt minuscule, sunt dificil de identificat morfologic și, de obicei, au o prevalență extrem de scăzută a infecției în rândul populațiilor de gazde intermediare nevertebrate (Cribb et al., 2011). Poate ca urmare a acestor atribute, gazda (gazdele) intermediară (intermediare) este (sunt) necunoscută (necunoscute) pentru toate speciile de FBF, cu excepția câtorva specii: mai multe specii din genul de apă dulce Sanguinicola (a se vedea Bullard și Overstreet, 2008) și speciile marine Aporocotyle simplex (a se vedea Køie, 1982; Køie și Petersen, 1988, infecții experimentale; nu s-au aplicat markeri moleculari), Paracardicoloides yamagutii (a se vedea Nolan și Cribb, 2004a; a se vedea textul care urmează), C. forsteri (a se vedea Cribb et al, 2011; a se vedea textul care urmează) și Cardicola opisthorchis (a se vedea Sugihara et al., 2014; a se vedea textul care urmează). Secvențele de ADNr ITS2 au fost utilizate pentru a compara exemplare de FBF larvare nedeterminate din punct de vedere morfologic, și anume, cercariae, sporociste și rediae, colectate de la gazde nevertebrate, cu exemplare adulte distincte din punct de vedere morfologic de la gazde de pești simpatrici. În mod rapid și ieftin, markerii moleculari permit detectarea rapidă a infecțiilor; identificarea agentului infecțios, prin inferență filogenetică sau prin omologia secvenței cu un taxon deja secvențiat; și identificarea gazdelor intermediare, făcând astfel legătura între etapele ciclului de viață al FBF potențial patogene. În mod cert, determinarea identității gazdelor intermediare și definitive reprezintă un prim pas esențial în înțelegerea ciclului de viață al FBF-urilor. Cu toate acestea, dincolo de abordările de diagnosticare, mai sunt încă multe de învățat despre detaliile specifice ale relației gazdă-parazit dintre FBF și gazdele lor intermediare polichete, gasteropode și bivalve. La urma urmei, este foarte posibil ca istoria evolutivă a acestora să fie influențată la fel de mult sau chiar mai mult de aceste gazde intermediare decât de gazdele lor definitive. Ca atare, susținem că studiile moleculare nu ar trebui să suplinească în totalitate studiile experimentale clasice care fac observații microscopice directe ale FBF-urilor larvare și adulte în țesuturile gazdelor, ca urmare a expunerii unor nevertebrate naive și a unor gazde definitive de pești (Køie, 1982).
Multe dintre informațiile privind ciclurile de viață ale FBF-urilor provin din programele de sănătate a animalelor acvatice legate de acvacultura comercială: 17 din 109 (16%) dintre cele 109 secvențe de FBF disponibile în GenBank provin din infecții în acvacultura marină (tabelul 1.1). FBF reprezintă unul dintre puținele grupuri de trematode ai căror membri pot afecta gazda definitivă a peștelui ca adulți care ocluzionează vasele de sânge și provoacă asfixie, ca ouă care deteriorează sau obstrucționează epiteliile branhiale și vasele branhiale și ca miracidii care eclozează din ouăle încorporate în epiteliul branhial și ies din pește (Bullard și Overstreet, 2002, 2008). Ca atare, ciclurile lor de viață reprezintă un motiv de îngrijorare pentru operațiunile comerciale de acvacultură, deoarece FBF pot ucide sau debilita peștii și pot cauza pierderi economice în iazurile de apă dulce, în cursele de reproducție și în cuștile marine din larg. Secvențele provenite de la FBF neadulte care infectează gazde gasteropode, bivalve și polichete, care adăpostesc stadii de reproducere asexuată a FBF – sporociste, rediae și cercariae – sunt mult mai puțin numeroase (4 din 109) (tabelul 1.1) decât cele provenite de la specimene adulte care infectează gazde de pești.
În primul studiu publicat privind ciclul de viață al FBF determinat prin aplicarea unei metode moleculare, Nolan și Cribb (2004a) au documentat două morfotipuri de cercari („tip A” și „tip B”) care au infectat 80 din 11.314 (0,7%) exemplare ale gasteropodului hidrobiid Posticobia brazieri din golfurile cu maree din Queensland, Australia. Secvențele ITS2 rDNA din cercaria de tip A s-au aliniat (concordanță de 100%) cu specimene adulte de P. yamagutii care au fost colectate din sânge (aorta dorsală, atriu, ventriculul, branhiile, rinichi și vasele de sânge din intestin și vezica nazală) ale anghilei cu aripioare lungi pătate Anguilla reinhardtii. Într-un alt studiu, ca răspuns la preocupările legate de bolile asociate cu infecțiile cu C. forsteri care infectează tonul roșu sudic de cultură T. maccoyii în largul Australiei de Sud, Cribb et al. (2011) au examinat 9351 de indivizi din 11 familii de bivalve, 2 familii de gasteropode și 24 de polichete pentru depistarea infecțiilor cu FBF. Datele secvenței ADNr ITS2 derivate din cercarii care au infectat Longicarpus modestus (Polychaeta: Terebellidae) s-au aliniat cu o concordanță de 100 % cu specimenele adulte de C. forsteri din inima tonului roșu din sud aflate în apropiere, într-un țarc cu plasă la Port Lincoln, Australia. Aceștia au secvențiat, de asemenea, fragmentul de ADNr 28S (721 bp în regiunea D1-D2) din cercaria de C. forsteri care a infectat L. modestus. Urmând abordarea lui Cribb et al. (2011), Sugihara et al. (2014) s-au concentrat pe polichete în timp ce examinau 744 de nevertebrate pentru infecții cu FBF într-un sit de cultură a tonului roșu din Pacific Thunnus orientalis, în largul sudului Japoniei. Sporocistele și cercarii de FBF au fost găsite în cinci indivizi ai unui polichet terebellid (Terebella) colectat din interiorul cochiliei unor scoici moarte prelevate de pe substrat și de pe frânghii și flotoare de sub cușca marină. Secvențele ITS2 și 28S din sporociste au fost identice (100%) cu cele ale adulților de C. opisthorchis din inima tonului roșu din Pacific cultivat.
Shirakashi et al. (2012) au studiat infecțiile concomitente de Cardicola orientalis și C. opisthorchis la tonul roșu din Pacific. Aceștia au utilizat datele secvenței ADNr ITS2 pentru a diferenția ouăle în formă de semilună ale lui C. opisthorchis în artera filamentului aferentă de ouăle ovoidale ale lui C. orientalis care infectează lamelulele branhiale. Aceștia au afirmat că primerii PCR specifici pentru fiecare specie în parte, aplicați pe eșantioane de țesut branhial, ar putea completa histopatologia și ar putea ajuta la diagnosticarea infecțiilor înainte ca ouăle și adulții să fie suficient de numeroși pentru a fi ușor de observat cu ajutorul microscopiei optice. Yong et al. (2013) au utilizat datele complete ale secvenței ITS2 rDNA pentru a identifica ouăle de FBF depuse în branhiile a cinci specii de pești fluture (Perciformes: Chaetodontidae) din Marea Barieră de Corali ca fiind o singură specie Cardicola chaetodontis (o singură pereche de baze de diferență în două probe). Ouăle de FBF nu sunt rareori observate în epiteliul branhial și în arteriolele branhiale ale peștilor în timpul necropsiilor de rutină ale peștilor (SAB, observații personale), dar, în multe cazuri, nu sunt recuperate specimenele adulte corespunzătoare care infectează sângele peștilor individuali. Tehnicile moleculare care extrag și amplifică în mod eficient ADN din ouăle de FBF, care sunt minuscule, de exemplu, ouăle de C. chaetodontis au o lungime totală de 40-60 μm, promit să dezvăluie prezența unor specii de FBF nenumite și a unor gazde nedocumentate până în prezent, dacă secvențele rezultate sunt plasate într-un context filogenetic cu secvențe de la specii numite. Același lucru se poate spune și despre secvențele derivate din cercariae (a se vedea textul următor). Utilizând reacția cantitativă în lanț a polimerazei (qPCR), Norte Do Santos et al. (2012) au identificat ouăle de C. forsteri agregate în branhiile tonului roșu de sud crescut în crescătorie. În mod similar, Kirchhoff et al. (2012) au aplicat această metodă pentru a diagnostica ouăle de C. forsteri care infectează T. maccoyii. Polinski et al. (2013) au dus abordarea un pas mai departe, dezvoltând o tehnică PCR în timp real sensibilă și precisă, care poate fi utilizată și pentru identificarea C. forsteri, C. orientalis și C. opisthorchis în eșantioane neletale. Nu a fost detectată nicio amplificare genomică a speciilor încrucișate sau a gazdei în niciuna dintre metodele testate, și anume qPCR pe bază de SYBR și un test TaqMan reporter comun; cu toate acestea, aplicarea lor combinată a îmbunătățit fiabilitatea diferențierii speciilor. Aceste metode au confirmat infecțiile concomitente de C. forsteri și C. orientalis la T. maccoyii, indicând, de asemenea, prevalența și distribuția mai mare a C. orientalis în gazdă.
Recent, utilitatea celor două tehnici dezvoltate a fost susținută pentru a evalua consecințele patologice ale infecțiilor cu FBF. Polinski et al. (2014) au combinat qPCR cu imunotranscrierea genei gazdei pentru a cuantifica cantitățile de ADN din țesuturile infectate de C. opisthorchis și C. orientalis. Aceștia au cuantificat, de asemenea, răspunsul imunitar temporal al gazdei la aceste infecții la tonul roșu din Pacific aflat în cușcă. Datele anterioare au documentat prezența adulților și a ouălor de C. orientalis în branhii (Ogawa et al., 2010; Shirakashi et al., 2012), în timp ce adulții și ouăle de C. opisthorchis au infectat inima și, respectiv, arterele branhiale aferente (Ogawa et al., 2011; Shirakashi et al., 2012). Cu toate acestea, rezultatele lui Polinski et al. (2014) au evidențiat o corelație a transcrierii IgM cu cantitățile mari de infecții „doar cu C. orientalis” în țesuturile branhiale, dar nu și cu ADN-ul de C. opisthorchis, sugerând că un astfel de răspuns imunitar în acest organ ar putea fi declanșat de prezența adulților, mai degrabă decât a ouălor. Mai mult, nivelurile ridicate de ADN de C. orientalis în inimă au fost atribuite prezenței fluviilor juvenili. Deși astfel de metode nu pot identifica etapele ciclului de viață al FBF sau dacă fluștii sunt vii sau morți, această abordare cantitativă permite conjecturarea intensității infecției și a stării de infectare, ceea ce reprezintă în sine un instrument promițător pentru viitoarele studii epidemiologice care implică pești sălbatici sau de cultură.
Brant et al. (2006) au folosit inferența filogenetică (28S, 18S și COI) în tratarea mai multor cercarii presupuse FBF neidentificate izolate de la gasteropode (Planorbidae și Thiaridae) în Uganda, Kenya și Australia. Aceștia au caracterizat morfologic cercarii cu ajutorul fotomicrografiilor și pe baza prezenței/absenței punctelor oculare, a pliurilor de înotătoare de pe coada și corpul cercariei și a formei cozii. Deși lipsește o definiție (diagnostic) consecventă și coerentă din punct de vedere filogenetic, bazată pe morfologie, a cercariei FBF, aceste cercarii sunt, de obicei, caracteristice: minuscule, cu coadă în formă de furcă, fără o ventrală ventrală, cu un organ de penetrare distinctiv care probabil cuprinde o ventuză anterioară specializată (Truong și Bullard, 2013), un pliu de înotătoare pe corpul cercariului și un pliu de înotătoare prezent sau absent pe furca cozii (Cribb et al., 2011). Una dintre aceste cercarii (W5004) a fost deosebit de bizară din punct de vedere morfologic, adică a fost descrisă ca fiind afaringeată și furcocoasă, dar cu „membrane laterale extravagante ale cozii și o formă ascuțită a corpului”, și niciuna dintre aceste cercarii nu avea toate caracteristicile tipice ale cercarii FBF (a se vedea textul anterior). Cu toate acestea, analiza combinată 18S și 28S a acestor cercariae le-a grupat cu alte secvențe FBF (presupunem că „Sanguinicolid sp.” este cea a „Sanguinicola cf. inermis” (AY222180)). Din acest motiv și pentru că erau bizare din punct de vedere morfologic în raport cu cercariae FBF cunoscute, acești autori au presupus că există o diversitate morfologică mult mai mare de cercariae FBF decât a fost recunoscută în literatura de specialitate până în prezent. Identitatea taxonomică și semnificația filogenetică a acestor secvențe sunt discutate mai departe în text.