2 Historia de la vida
Las cercarias de la FBF son diminutas, son difíciles de identificar morfológicamente y suelen tener una prevalencia de infección extremadamente baja entre las poblaciones de huéspedes intermedios invertebrados (Cribb et al., 2011). Tal vez como resultado de estos atributos, se desconoce el hospedador o los hospedadores intermedios de todas las especies de FBF, salvo unas pocas: varias especies del género de agua dulce Sanguinicola (véase Bullard y Overstreet, 2008) y las especies marinas Aporocotyle simplex (véase Køie, 1982; Køie y Petersen, 1988, infecciones experimentales; no se aplicaron marcadores moleculares), Paracardicoloides yamagutii (véase Nolan y Cribb, 2004a; véase el texto siguiente), C. forsteri (véase Cribb et al, 2011; véase el texto siguiente), y Cardicola opisthorchis (véase Sugihara et al., 2014; véase el texto siguiente). Las secuencias de ITS2 rDNA se han utilizado para emparejar especímenes larvales de FBF morfológicamente indeterminados, es decir, cercarias, esporoquistes y redios, recogidos de huéspedes invertebrados con especímenes adultos morfológicamente distintivos de huéspedes de peces simpáticos. Los marcadores moleculares permiten detectar rápidamente las infecciones, identificar el agente infeccioso, por inferencia filogenética o por homología de secuencia con un taxón ya secuenciado, e identificar los huéspedes intermedios, vinculando así las etapas del ciclo vital de los FBF potencialmente patógenos. No cabe duda de que la determinación de la identidad de los huéspedes intermedios y definitivos constituye un primer paso fundamental para comprender el ciclo vital de los FBF. Sin embargo, más allá de los enfoques de diagnóstico, queda mucho por aprender sobre los detalles específicos de la relación huésped-parásito entre los FBF y sus huéspedes intermedios poliquetos, gasterópodos y bivalvos. Al fin y al cabo, su historia evolutiva puede estar tan influenciada, o más, por estos huéspedes intermedios como por sus huéspedes definitivos. Por ello, sostenemos que los estudios moleculares no deberían suplantar del todo a los estudios experimentales clásicos que realizan observaciones directas con microscopio de los FBFs larvales y adultos en los tejidos de los hospedadores tras la exposición de los hospedadores invertebrados y definitivos ingenuos (Køie, 1982).
Mucha de la información relativa a los ciclos de vida de los FBFs se origina en los programas de salud de los animales acuáticos vinculados a la acuicultura comercial: 17 de 109 (16%) de las secuencias de FBF disponibles en el GenBank proceden de infecciones en la acuicultura marina (Tabla 1.1). Los FBF constituyen uno de los pocos grupos de trematodos cuyos miembros pueden dañar al huésped definitivo de los peces como adultos que ocluyen los vasos sanguíneos y causan asfixia, como huevos que dañan u obstruyen los epitelios branquiales y los vasos branquiales, y como miracidios que eclosionan de los huevos incrustados en el epitelio branquial y salen del pez (Bullard y Overstreet, 2002, 2008). Como tal, sus ciclos vitales son motivo de preocupación para las operaciones de acuicultura comercial porque los FBF pueden matar o debilitar a los peces y causar pérdidas económicas en los estanques de agua dulce, las pistas de carreras y las jaulas marinas de alta mar. Las secuencias procedentes de FBF no adultos que infectan a huéspedes gasterópodos, bivalvos y poliquetos, que albergan las fases reproductivas asexuales de los FBF -esporocisto, rediae y cercaria- son mucho menos numerosas (4 de 109) (Tabla 1.1) que las procedentes de especímenes adultos que infectan a huéspedes peces.
En el primer estudio publicado sobre el ciclo vital de la FBF determinado por la aplicación de un método molecular, Nolan y Cribb (2004a) documentaron dos morfotipos de cercarias («tipo A» y «tipo B») que infectaban a 80 de 11.314 (0,7%) especímenes del gasterópodo hidrobiano Posticobia brazieri en los arroyos de marea de Queensland, Australia. Las secuencias de ITS2 rDNA de la cercaria tipo A se alinearon (100% de concordancia) con especímenes adultos de P. yamagutii que se recogieron de la sangre (la aorta dorsal, la aurícula, el ventrículo, las branquias, el riñón y los vasos sanguíneos del intestino y la vejiga natatoria) de las anguilas de aleta larga moteadas Anguilla reinhardtii. En otro estudio, en respuesta a la preocupación por las enfermedades asociadas a las infecciones de C. forsteri que infectan al atún rojo del sur T. maccoyii cultivado en las costas del sur de Australia, Cribb et al. (2011) examinaron 9351 individuos de 11 familias de bivalvos, 2 de gasterópodos y 24 de poliquetos en busca de infecciones por FBF. Los datos de la secuencia ITS2 rDNA derivados de la cercaria que infectó a Longicarpus modestus (Polychaeta: Terebellidae) se alinearon con una concordancia del 100% con los especímenes adultos de C. forsteri del corazón del atún rojo del sur cercano en un corral de red en Port Lincoln, Australia. También secuenciaron el fragmento de ADNr 28S (721 pb en la región D1-D2) de la cercaria de C. forsteri que infectó a L. modestus. Siguiendo el planteamiento de Cribb et al. (2011), Sugihara et al. (2014) se centraron en los poliquetos al examinar 744 invertebrados en busca de infecciones por FBF en un lugar de cultivo del atún rojo del Pacífico Thunnus orientalis, al sur de Japón. Se encontraron esporoquistes y cercaria de FBF en cinco individuos de un poliqueto terebélido (Terebella) recogidos dentro de la concha de percebes muertos tomados del sustrato y de cuerdas y flotadores debajo de la jaula marina. Las secuencias ITS2 y 28S de los esporoquistes eran idénticas (100%) a las de los adultos de C. opisthorchis del corazón del atún rojo del Pacífico cultivado.
Shirakashi et al. (2012) estudiaron las infecciones concurrentes de Cardicola orientalis y C. opisthorchis en el atún rojo del Pacífico. Utilizaron datos de la secuencia de ITS2 rDNA para diferenciar los huevos en forma de media luna de C. opisthorchis en la arteria del filamento aferente de los huevos ovoides de C. orientalis que infectan las láminas branquiales. Afirmaron que los cebadores de PCR específicos de la especie aplicados a las muestras de tejido branquial podrían complementar la histopatología y ayudar a diagnosticar las infecciones antes de que los huevos y los adultos fueran lo suficientemente numerosos como para ser observados fácilmente con el microscopio óptico. Yong et al. (2013) utilizaron datos de la secuencia completa de ITS2 rDNA para identificar los huevos de FBF alojados en las branquias de cinco especies de peces mariposa (Perciformes: Chaetodontidae) de la Gran Barrera de Coral como una única especie Cardicola chaetodontis (una única diferencia de par de bases en dos muestras). No es infrecuente que se observen huevos de FBF en el epitelio de las branquias y en las arteriolas branquiales de los peces durante las necropsias rutinarias de los mismos (SAB, observaciones personales), pero en muchos casos no se recuperan los correspondientes ejemplares adultos que infectan la sangre de los peces individuales. Las técnicas moleculares que extraen y amplifican eficazmente el ADN de los huevos de FBF, que son diminutos, por ejemplo, los huevos de C. chaetodontis tienen una longitud total de 40-60 μm, prometen revelar la presencia de especies de FBF sin nombre y de huéspedes hasta ahora no documentados si las secuencias resultantes se colocan en un contexto filogenético con secuencias de especies con nombre. Lo mismo puede decirse de las secuencias derivadas de las cercarías (véase el texto siguiente). Utilizando la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR), Norte Do Santos et al. (2012) identificaron los huevos de C. forsteri agregados en las branquias del atún rojo del sur criado en granjas. Del mismo modo, Kirchhoff et al. (2012) aplicaron este método para diagnosticar los huevos de C. forsteri que infectaban a T. maccoyii. Polinski et al. (2013) llevaron el enfoque un paso más allá al desarrollar una técnica de PCR en tiempo real sensible y precisa que también puede utilizarse para la identificación de C. forsteri, C. orientalis y C. opisthorchis en muestras no letales. No se detectó ninguna amplificación genómica cruzada o del huésped en ninguno de los dos métodos probados, es decir, la qPCR basada en SYBR y un ensayo TaqMan reportero común; sin embargo, su aplicación combinada mejoró la fiabilidad para diferenciar las especies. Estos métodos han confirmado infecciones concurrentes de C. forsteri y C. orientalis en T. maccoyii, indicando también la mayor prevalencia y distribución de C. orientalis en el hospedador.
Recientemente, la utilidad de ambas técnicas desarrolladas fue apoyada para evaluar las consecuencias patológicas de las infecciones de FBF. Polinski et al. (2014) combinaron la qPCR con la transcripción inmunitaria de genes del huésped para cuantificar las cantidades de ADN de los tejidos infectados por C. opisthorchis y C. orientalis. También cuantificaron la respuesta inmunitaria temporal del huésped a esas infecciones en atunes rojos del Pacífico enjaulados. Datos anteriores documentaron adultos y huevos de C. orientalis en las branquias (Ogawa et al., 2010; Shirakashi et al., 2012), mientras que los adultos y los huevos de C. opisthorchis infectaron el corazón y las arterias branquiales aferentes, respectivamente (Ogawa et al., 2011; Shirakashi et al., 2012). Los resultados de Polinski et al. (2014), sin embargo, revelaron una correlación de la transcripción de IgM con las altas cantidades de infecciones de «C. orientalis solamente» en los tejidos de las branquias, pero no con el ADN de C. opisthorchis, lo que sugiere que dicha respuesta inmune en este órgano podría ser desencadenada por la presencia de adultos y no de huevos. Además, los altos niveles de ADN de C. orientalis en el corazón se atribuyeron a la presencia de alevines. Aunque estos métodos no pueden identificar los estadios de la historia vital de la FBF o si los trematodos están vivos o muertos, este enfoque cuantitativo permite conjeturar sobre la intensidad y el estado de la infección, lo que constituye en sí mismo una herramienta prometedora para futuros estudios epidemiológicos con peces salvajes o cultivados.
Brant et al. (2006) utilizaron la inferencia filogenética (28S, 18S y COI) en el tratamiento de varias cercarías putativas de FBF no identificadas aisladas de gasterópodos (Planorbidae y Thiaridae) en Uganda, Kenia y Australia. Caracterizaron morfológicamente las cercarías con fotomicrografías y basándose en la presencia/ausencia de manchas oculares, los pliegues de las aletas en la cola y el cuerpo de las cercarías, y la forma de la cola. Aunque se carece de una definición (diagnóstico) consistente y filogenéticamente coherente basada en la morfología de las cercarías de la FBF, estas cercarías son típicamente distintivas: diminutas, con cola de tenedor, sin ventosa ventral, con un órgano penetrante distintivo que probablemente comprende una ventosa anterior especializada (Truong y Bullard, 2013), un pliegue de aleta en el cuerpo de la cercaria, y un pliegue de aleta presente o ausente en las furcas de la cola (Cribb et al., 2011). Una de estas cercarías (W5004) era especialmente extraña desde el punto de vista morfológico, es decir, se describió como afarín y furcocerca pero con «membranas laterales extravagantes en la cola y una forma de cuerpo puntiaguda», y ninguna de estas cercarías tenía todas las características típicas de las cercarías de la FBF (véase el texto anterior). Sin embargo, el análisis combinado de 18S y 28S de estas cercarías las agrupó con otras secuencias de FBF (suponemos que «Sanguinicolid sp.» es la de «Sanguinicola cf. inermis» (AY222180)). Por esta razón y porque eran morfológicamente extrañas en relación con las cercarías de FBF conocidas, estos autores postularon que existe una diversidad morfológica de cercarías de FBF mucho mayor de la que se ha reconocido en la literatura hasta la fecha. La identidad taxonómica y la importancia filogenética de estas secuencias se discuten más adelante en el texto.