Alle levende organismer har udviklet måder at beskytte sig mod abiotiske og biotiske angreb på. Mikrober anvender f.eks. DNA-restriktion/modifikationssystemer til at beskytte sig mod fremmed DNA; de indeholder også systemer til at afgifte og/eller udtrænge xenobiotika eller overdrevne reaktive oxygenarter (ROS). Flercellede organismer anvender andre systemer, og der er ofte tale om deltagelse af et eller flere immunitetsniveauer. Det bedst undersøgte og mest værdsatte system hos hvirveldyr med kæber er det erhvervede/adaptive immunsystem med dets velkendte B- og T-celler og antigenspecifikke antistoffer. Dette immunitetsniveau er overlejret det langt mere grundlæggende, evolutionært gamle medfødte immunsystem, som ikke kun findes hos pattedyr, men også hos andre dyr og hos planter. Det er først i de sidste årtier, at man er begyndt at forstå betydningen af den medfødte immunitet for flercellede organismers overlevelse. Det beskytter mennesker, andre dyr og planter mod de tusindvis af potentielt skadelige mikrober, som man dagligt støder på. Udviklingen af den medfødte immunitet hos flercellede organismer krævede udvikling af celleoverfladereceptorer, der kunne genkende/binde molekyler, hvis kemiske struktur/mønster generelt er bevaret inden for forskellige klasser af fremmede organismer, men som ikke findes i “egne” molekyler. Disse bevarede fremmede (ikke-selv) molekyler kaldes Microbe-Associated Molecular Patterns (MAMP’er), også kaldet Pathogen-Associated Molecular Patterns (PAMP’er), og deres tilstedeværelse påvises af medlemmer af en stor familie af mønstergenkendelsesreceptorer (PRR’er). PRR’er aktiverer en eller flere signalveje, ofte ved hjælp af co-receptorer, for at fremkalde nedstrømsforsvarsreaktioner. Eksempler på MAMP’er omfatter bakteriel lipopolysaccharid, flagellin, EF-Tu, DNA, lipoproteiner, peptidoglykaner og svampekitin. Der findes flere fremragende oversigter over MAMP’er.
Ud over biotiske angreb skal organismer klare en række abiotiske angreb som f.eks. mekaniske eller cellulære skader samt miljøstress som tørke og saltholdighed. Nogle endogene molekyler aktiverer det medfødte immunsystem, når de frigives i det ekstracellulære rum (herunder planteapoplast) fra deres normale placering på grund af skade (traume); disse molekyler kaldes Damage-Associated Molecular Patterns (DAMPs ). DAMP’er frigives passivt fra døende celler som følge af skader, traumer, iskæmi eller infektionsinduceret nekrose. Desuden kan de aktivt udskilles af visse immunceller eller stærkt stressede celler (f.eks. visse kræftceller). Mens MAMP’er stammer fra mikroorganismer og aktiverer det medfødte immunsystem, stammer DAMP’er fra værtsceller og både udløser og opretholder medfødte immunreaktioner. Det er almindeligt anerkendt, at disse forsvarsmekanismer bidrager til at beskytte det beskadigede væv, som er sårbart over for infektion på grund af forstyrrelsen af de fysiske barrierer, der ellers ville forhindre mikroorganismer i at trænge ind. Hos pattedyr er inflammation en anden komponent i det medfødte immunforsvar; den bidrager ikke kun til at forebygge/undertrykke infektioner, men hjælper også med at helbrede.
Denne gennemgang vil fokusere på DAMP’er, især dem fra planter. DAMPs vil blive sammenlignet med MAMPs og med en nyligt identificeret klasse af medfødte immunitetsaktivatorer kaldet Nematode-Associated Molecular Patterns (NAMPs ), da alle tre klasser inducerer mange af de samme forsvarsresponser og deler nogle signaltransduktionskomponenter.
Dyre DAMPs
Vi begynder vores diskussion med dyre-DAMPs, da de først blev anerkendt og mest omfattende undersøgt. Udtrykket DAMPs blev opfundet af Seong og Matzinger i 2004 . Tabel 1 indeholder en liste over 26 DAMP’er, herunder puriner, pyrimidiner, DNA (umethyleret CpG), oxiderede low-density lipoproteiner, N-formylpeptider og en række proteiner. Der er identificeret beslægtede receptorer for de fleste (tabel 1). Desuden danner nogle DAMP’er komplekser med partnermolekyler/interaktorer for at forstærke eller lette signaleringen. Blandt disse er High Mobility Group Box 1 (HMGB1), som er en af de første identificerede og bedst karakteriserede DAMP’er. HMGB1 er et meget hyppigt kromatin-associeret protein, der findes i alle dyreceller . Det består af to grundlæggende DNA-bindende domæner, der betegnes HMG-boks A og B, og en meget sur C-terminal hale, der deltager i specifikke intramolekylære interaktioner . I kernen binder HMGB1 til DNA’s minor groove for at lette DNA-kondensering, nukleosomdannelse og binding af transkriptionsfaktorer . Når det frigives i det ekstracellulære miljø fra nekrotiske, beskadigede eller alvorligt stressede celler, fungerer det som en DAMP med kemotiltrækkende og cytokininducerende aktiviteter .
Extracellulært HMGB1 medierer en række biologiske reaktioner i forbindelse med flere receptorer, såsom Receptor for Advanced Glycation End products (RAGE), Toll-like receptor 2 (TLR2), TLR4, TLR9, C-X-C kemokinreceptor type 4 (CXCR4), Siglec-10 og T-Cell Immunoglobulin Mucin Receptor 3 (TIM3) . Navnlig er specifik heterokompleksdannelse mellem HMGB1 og en række interaktorer, såsom adaptor MD-2 eller proinflammatoriske ligander lipopolysaccharider og CpG-oligodeoxynukleotider, der forbedrer eller letter signaleringen og i nogle tilfælde er afgørende for HMGB1’s genkendelse af forskellige receptorer (tabel 1). Den specifikke heterokompleksdannelse synes i det mindste delvist at være reguleret af HMGB1’s forskellige redoxtilstande, som til dels afhænger af en reversibel intramolekylær disulfidbinding, der dannes mellem cysteinresterne 23 og 45 . Nylige undersøgelser viste, at reduceret HMGB1 danner et heterokompleks med CXCL12, som fremmer rekruttering af inflammatoriske celler til skadet væv gennem genkendelse af CXCR4-receptoren . HMGB1 indeholdende disulfidbindinger binder specifikt MD-2, som letter genkendelse af TLR4, hvilket fører til induktion af NF-κB-medieret transkriptionel aktivering af proinflammatoriske cytokiner . HMGB1 interagerer også med flere andre receptorer, herunder RAGE og TLR2; det er på nuværende tidspunkt uklart, om specifikke redoxtilstande er nødvendige for, at HMGB1 kan genkendes af disse receptorer . HMGB1’s forskellige aktiviteter, partnermolekyler og receptorer forklarer sandsynligvis dets mange roller i mange udbredte, ødelæggende menneskelige sygdomme.
Vi har for nylig opdaget, at HMGB1 binder salicylsyre (SA); dette undertrykker både reduceret HMGB1’s kemotiltrækkende aktivitet og disulfidbindingsholdige HMGB1’s evne til at inducere ekspression af pro-inflammatoriske cytokingener og COX-2 . De SA-bindingssteder på HMGB1 blev identificeret i HMG-box-domænerne ved NMR-undersøgelser og bekræftet ved mutationsanalyse. Et HMGB1-protein, der er muteret i et af de SA-bindingssteder, beholdt den kemotiltrækkende aktivitet, men mistede bindingen af og inhiberingen af SA, hvorved det blev slået fast, at SA-binding til HMGB1 direkte undertrykker dets proinflammatoriske aktiviteter. Der blev også identificeret naturlige og syntetiske SA-derivater med meget større styrke til hæmning af HMGB1, hvorved det blev bevist, at nye SA-baserede molekyler med høj effektivitet er opnåelige.
Planter DAMPs
I modsætning til dyr er der hidtil blevet identificeret langt færre DAMPs i planter (tabel 2). Den største og vel nok bedst karakteriserede klasse er polypeptider/peptider produceret fra større forstadieproteiner. Disse omfatter tre familier, som Ryan og hans kolleger opdagede under deres undersøgelser for at identificere systemin – et begreb “der bruges til at beskrive polypeptidforsvarssignaler, som produceres af planten som reaktion på fysisk skade, og som inducerer forsvarsgener, enten lokalt eller systemisk” . Et polypeptid på 18 aminosyrer (aa) blev isoleret fra 60 lb af tomatfrøplanter og viste sig at inducere syntesen af sårinducerbare proteinaseinhibitorproteiner . Dette tomatsystemin genereres ved sårinduceret behandling af et 200 aa prohormon prosystemin, som befinder sig i cytoplasmaet i vaskulære phloemparenchymaceller. Systemin inducerer de tilstødende kompagnonceller og sielementer i det vaskulære bundt til at syntetisere jasmonsyre (JA), som igen systemisk aktiverer ekspressionen af proteinaseinhibitorgener .
Mens systemin findes i mange andre Solanaceous arter, herunder kartoffel, peber og natskygge , findes det ikke i tobak. Dette resultat fik Ryan’s gruppe til at søge efter en anden type systemin. I sidste ende blev der identificeret to hydroxyprolin-rige 18 aa polypeptider, der er behandlet fra et 165 aa præprotein, men som ikke deler nogen sekvenshomologi med tomatsystemin.
En tredje familie af peptidbaserede DAMP’er blev opdaget i Arabidopsis . Disse 23 aa planteelicitorpeptider (Peps) er afledt af en 92 aa forløber. Der er blevet identificeret to receptorer for AtPepl, PEPR1 og PEPR2 . AtPeps fremkalder en række forskellige medfødte immunreaktioner og øget modstandsdygtighed, og en form af forløberen ProPep3 blev for nylig vist at blive frigivet i det ekstracellulære rum ved infektion af Arabidopsis med hemi-biotrofisk Pseudomonas syringae . En ortolog af majs (Zea mays), ZmPep1, blev efterfølgende identificeret og viste sig at øge resistensen over for mikrobielle patogener, ligesom AtPepl . For en mere dybtgående diskussion af endogene peptidelicitorer, se Yamaguchi og Huffaker .
En anden klasse af DAMPs, der findes i planter såvel som i dyr, stammer fra den ekstracellulære matrix. Hos hvirveldyr inducerer fragmenter af hyaluronan, et simpelt lineært polysaccharid bestående af gentagende D-glucuronsyre og D-N-acetylglucosamin, medfødt immunitet, når de frigøres ved mekanisk beskadigelse eller hydrolytiske enzymer . Disse fragmenter opfattes af de leucinrigt gentagne TLR2- og TLR4-receptorer, der indeholder leucinrige gentagelser . På samme måde indeholder planter det pectiske polysaccharid homogalacturonan, en lineær polymer af 1,4-bundet α-D-galacturonsyre, som er med til at opretholde cellevæggens integritet. Fragmenter af denne polymer, kaldet oligogalacturonider (OGs), kan frigøres mekanisk eller mere almindeligt af patogenkodede hydrolytiske enzymer. OG’er fremkalder medfødte immunreaktioner, herunder MAPK-aktivering, calloseaflejring, ROS-produktion, forhøjet cytosolisk Ca2+ og aktivering af forsvarsgener . Den væg-associerede kinase 1 (WAK1) er blevet identificeret som en sandsynlig receptor for OG’er.
Ekstracellulær ATP (eATP) udgør endnu en klasse af plante-DAMP’er, der findes i både planter og dyr. På trods af årtiers stigende beviser for, at eATP fungerer som et signalmolekyle, blev denne funktion stort set diskonteret/diskrediteret, sandsynligvis på grund af ATP’s allestedsnærværende natur og centrale rolle som den universelle energiværdi i alle levende organismer fra bakterier til mennesker . Først med identifikationen af dets receptorer, der er lokaliseret i plasmamembranen, først hos dyr (se ) og derefter hos planter , blev dets signalfunktion accepteret i begge riger. Hos dyr fungerer eATP som en neurotransmitter og et signalmolekyle, der deltager i muskelkontraktion, celledød og inflammation . Der er to typer af receptorer involveret: en G-protein-koblet P2Y-receptor og en ligand-gated ionkanal P2X-receptor. I planter er eATP’s signalfunktion for nylig blevet bekræftet med identifikationen af dets receptor, Does not Respond to Nucleotides 1 (DORN1 ). eATP’s betegnelse som en plante-DAMP er baseret på de kombinerede observationer, at i) dorn1-mutanten udviser undertrykt transkriptionelt respons ikke kun på ATP, men også på sårdannelse, ii) de fleste af de gener, der induceres ved anvendelse af eATP, er også sårinducerbare , og iii) eATP-behandling inducerer typiske medfødte immunreaktioner, herunder cytosolisk Ca2+-tilstrømning, MAPK-aktivering og induktion af tæt-associerede gener, herunder nogle, der er involveret i biosyntesen af JA og ethylen . Det vides dog endnu ikke, om det bidrager til resistens over for patogener.
Vi har for nylig identificeret en fjerde klasse af plante-DAMPs, Arabidopsis HMGB-proteinet AtHMGB3 . Alle eukaryote celler, herunder planter, har HMGB1-relaterede proteiner. I Arabidopsis koder 15 gener for HMG-box-domæneholdige proteiner. De er blevet underopdelt i fire grupper: (i) proteiner af HMGB-typen, (ii) A/T-rigt interaktionsdomæne (ARID)-HMG-proteiner, (iii) 3xHMG-proteiner, der indeholder tre HMG-bokse, og (iv) det strukturspecifikke genkendelsesprotein 1 (SSRP1) . På grundlag af deres nukleare placering og domænestruktur menes de otte proteiner af HMGB-typen (HMGB1/2/3/4/4/5/5/6/6/12/14) at fungere som arkitektoniske kromosomale proteiner i lighed med pattedyrs HMGB1. Det skal bemærkes, at AtHMGB2/3/4 er til stede i cytoplasmaet og såvel som i kernen . Den cytoplasmatiske funktion af disse proteiner er ukendt. De cytoplasmatiske subpopulationer skulle imidlertid have større adgang til det ekstracellulære rum (apoplasten) efter cellebeskadigelse sammenlignet med AtHMGB’er, der udelukkende befinder sig i kernen , da de ikke er bundet til DNA og kun behøver at krydse plasmamembranen for at komme ind i apoplasten. I betragtning af den veletablerede rolle, som HMGB1 fra pattedyr spiller som prototypisk DAMP, gav tilstedeværelsen af en cytoplasmatisk subpopulation af AtHMGB3 anledning til at overveje muligheden for, at dette protein har en lignende funktion. Når rekombinant AtHMGB3 blev infiltreret i Arabidopsis-blade, udviste det faktisk DAMP-lignende aktiviteter svarende til dem af AtPep1. Behandling med begge proteiner inducerede MAPK-aktivering, calloseaflejring, forsvarsrelateret genekspression og øget modstand mod nekrotrof Botrytis cinerea .
I modsætning til HMGB1 fra pattedyr, som kan udskilles aktivt efter posttranslationel modifikation, er der ingen beviser for sekretion af AtHMGB3. Det kommer sandsynligvis passivt ind i det ekstracellulære rum, når celler beskadiges mekanisk, f.eks. af insekter, eller under infektion med nekrotrofiske patogener. B. cinerea-infektion forårsagede faktisk frigivelse af AtHMGB3 i apoplasten inden for 24 timer efter inokulation. En sådan hurtig frigivelse i den tidlige fase af cellulær nekrose induceret af nekrotrofer kunne øge modstandsdygtigheden ved at aktivere immunreaktioner .
Supplerende analyser afslørede, at AtHMGB3, ligesom HMGB1, binder SA, og at denne interaktion, som er medieret af konserverede Arg- og Lys-rester i AtHMGB3’s enkelte HMG-boks, hæmmer dens DAMP-aktivitet . Dette resultat synes at være i modstrid med SA’s velkendte rolle som en positiv regulator af immunreaktioner . Mens SA-inducerede forsvarsresponser er afgørende for resistens over for biotrofe og hemi-biotrofe patogener, er det vigtigste hormon, der er ansvarlig for aktivering af forsvaret mod nekrotrofe patogener og insekter, imidlertid JA . JA- og SA-forsvarssignalvejene er generelt gensidigt antagonistiske . SA-medieret hæmning af AtHMGB3’s DAMP-aktivitet kan derfor udgøre en mekanisme, hvorigennem disse veje krydstalerer. I dette scenarie ville cellulær skade forårsaget af infektion med nekrotrofiske patogener føre til frigivelse af AtHMGB3 i de ekstracellulære rum; dette ville aktivere JA/ethylen-associerede forsvarsmekanismer for at hjælpe med at neutralisere denne trussel. I modsætning hertil inducerer infektion med biotrofe patogener SA-biosyntese . Øgede SA-niveauer kunne derefter modvirke aktiveringen af JA-associerede forsvar ved at undertrykke AtHMGB3’s DAMP-aktivitet, samt fremme aktiveringen af SA-associerede forsvar, der er mere effektive mod denne type patogen .
Den opdagelse, at ekstracellulær AtHMGB3 er en plante-DAMP, hvis immunrespons-inducerende aktivitet hæmmes af SA-binding, giver beviser på tværs af rigsdele for, at HMGB-proteiner fungerer ekstracellulært som DAMP’er i både planter og dyr. Desuden fremhæver det eksistensen af fælles mål og delte virkningsmekanismer for SA i planter og mennesker. Det er interessant, at størstedelen af de plante-DAMP’er, der er identificeret til dato, har modstykker i dyr. Vores undersøgelser har desuden vist, at planter og dyr har fælles mål for SA ud over HMGB’erne . F.eks. binder det glykolytiske enzym glyceraldehyd-3-fosfatdehydrogenase (GAPDH) i både planter og mennesker SA og har som følge heraf en ændret aktivitet. SA undertrykker GAPDH’s roller i replikation af Tomato Bushy Stunt Virus i planter og kan have lignende virkninger på replikation af hepatitis C-virus hos mennesker . Det undertrykker også GAPDH-medieret neuronal celledød hos dyr . Foreløbige analyser af high-throughput-screeninger tyder på, at der findes mange flere SA-mål i både planter og mennesker. Måske har tilstedeværelsen af flere SA-mål hos dyr udviklet sig som reaktion på enten indtagelse af lave niveauer af SA, der er naturligt til stede i plantemateriale, eller endogen syntese af SA fra benzoater . Fremtidige undersøgelser vil være nødvendige for at vurdere, om disse nye plante- og dyreproteiner, der interagerer med SA, fungerer som DAMP’er.
NAMP’er
Nematoder, der er et af de hyppigst forekommende dyr i naturen, parasiterer både planter og dyr. Flere undersøgelser viste, at planter kunne opfatte infektion af nematoder , men identiteten af det opfattede nematodeafledte signal var ukendt. Vi har for nylig identificeret en gruppe af forsvarssignalmolekyler fra flere slægter af planteparasitære nematoder, herunder både rodknude- og cystenematoder . De er en evolutionært bevaret familie af feromoner fra nematoder kaldet ascarosider. Ascr#18, det hyppigst forekommende ascarosid i planteparasitiske nematoder, inducerer karakteristiske medfødte immunreaktioner, herunder aktivering af i) MAPK’er, ii) forsvarsgener og iii) SA- og JA-forsvarssignalveje samt øget modstandsdygtighed over for virale, bakterielle, svampe- og oomycetpatogener og rodknoldet nematoder i flere dicot- og monokotplantearter.
MAMP’er, DAMP’er og NAMP’er
Og selv om kilderne til de inducerende signaler er meget forskellige, idet MAMP’er stammer fra mikrober, NAMP’er stammer fra nematoder, og DAMP’er er endogene molekyler, der er placeret på en uhensigtsmæssig måde, tyder undersøgelser af Arabidopsis på, at de fleste medlemmer af disse tre klasser af immuninducerende molekyler aktiverer den medfødte immunsignalering via veje, der deler de samme leucin-rige gentagne receptorlignende kinaser BRI1-Associeret Kinase1 (BAK1) og BAK1-Like Kinase1 (BKK1) (, for NAMP upubliceret resultat M. Manohar, F.C. Schroeder og D.F. Klessig). Desuden inducerer disse molekyler mange af de samme medfødte immunforsvarsreaktioner, herunder en tilstrømning af Ca+2 til cytosolen, calloseaflejring, aktivering af de forsvarsassocierede MAPK’er MPK3 og MPK6, produktion af ROS og øget ekspression af mange forsvarsrelaterede gener (tabel 3). Der er blevet identificeret plantereceptorer for flere MAMP’er, såsom FLS2 for flagellin/flg22 og EFR for EF-Tu/elf18 . Der er også blevet opdaget receptorer for de fleste plante-DAMP’er, herunder Arabidopsis PEPR1/2 for Peps , Arabidopsis WAK1 for OGs og Arabidopsis DORN1 for eATP . Mens tomat SR160 oprindeligt blev rapporteret som receptor for systemin , hævder to nyere undersøgelser, at den ikke er det . Plantereceptorerne for AtHMGB3 og ascarosidet NAMP ascr#18 er fortsat ukendte (tabel 2). Det vides heller ikke, om AtHMGB3’s DAMP-signalering forstærkes eller lettes af interagerende molekyler, som det er blevet vist for HMGB1 fra pattedyr.